Measurement of anti-inflammatory activity by nitrite quantification

HPLC method validation

The method was validated with standards in terms of linearity, intra-day and inter-day precision and accuracy. The linearity of the HPLC method was performed with six different concentrations of standards prepared and analyzed in triplicate for each concentration in the 0.01 to 0.5 mg/mL range. Calibration curves were constructed by plotted peak areas (U.A) against concentrations (mg/mL). The linearity was assessed by calculating the slope, yintercept and coefficient of correlation (r2) using least squares regression. The calculations for the limits of detection (LOD) were based on the standard deviation of y-intercepts of the regression lines (σ) and the slope (S), using the following equation LOD = 3.3 σ/S. Limits of quantitation (LOQ) were calculated by the equation LOQ = 10 σ/S.
The precision of the method was evaluated with respect to both intra-day and inter-day precision. Three replicates of each level of phenolic acid standards were assayed in one run for the intraday experiment. Three replicates of each level of phenolic acid standards were assayed within three different days for the inter-day experiment. The intra-day and inter-day precision and accuracy of the assay were determined by Relative standard deviation (RSD).
The accuracy of the method was evaluated using the recovery test. At each level, samples were analyzed in triplicates according to the previously described chromatographic conditions.

Measurement of different biological activities

ORACFL assay

The procedure was modified from the method described by Ou et al. (2001) (Ou et al. 2001). Briefly, the ORAC assay was carried out on a Fluoroskan Ascent Fl™ plate reader (Labsystems). Trolox was used as a control standard. The experiment was conducted at 37.5 °C and pH 7.4, with a blank sample in parallel. The fluorimeter was programmed to record the fluorescence of fluorescein every 1 min after addition of 2,2ʹ-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). The final results were calculated by comparing the net areas under the fluorescein decay curves between the blank and the samples. ORAC values were expressed in micromoles of Trolox equivalents (TE) per milligram (μmol TE/mg).

Antioxidant cell assay using 2ʹ,7ʹ-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA)

Antioxidant activity was evaluated using the DCFH-DA assay as described by Girard- Lalancette et al. (2009) (Girard-Lalancette et al. 2009), with some modifications. Briefly, WS1 cells were plated in 96 microwell plates at 10,000 cells per well and incubated for 24 h at 37 °C and 5% CO2. The cells were washed with 150 μl Hank’s balanced salt solution (HBSS) at pH 7.4 and incubated for 30 min with 100 μl HBSS (pH 7.4) containing 5 μM DCFH-DA (Sigma– Aldrich). The cells were then washed again with 150 μl HBSS. To assess antioxidant activity, the cells were incubated either with a growing concentration of enriched fraction from Aralia nudicaulis, trolox or quercetin, in the absence or presence of 200 μM tert-butylhydroperoxide (tBH). Fluorescence was measured after 1 h and 4 h on the automated plate reader (Fluoroskan Ascent FL™, Labsystems) using an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 530 nm.

Measurement of anti-inflammatory activity by nitrite quantification

Exponentially growing RAW 264.7 (murine macrophages) were plated in 96-well microplates (BD Falcon) at a density of 7.5×104 cells per well in 100 μl of culture medium (DMEM) and were allowed to adhere overnight. Cells were then treated with or without positive control N(w)-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME, ≥98%, Sigma–Aldrich), or increasing concentrations of extracts dissolved in DMSO, the final concentration of solvent in the culture medium was maintained at 0.5% (v/v) to avoid solvent toxicity. Cells were then stimulated with 100 μg/ml lipopolysaccharide (LPS) and incubated at 37 °C, 5% CO2 for 24 h.
After 24 h, cell-free supernatants were collected and immediately determined using the Griess reaction (Adams et al. 1990) with minor modifications. Briefly, 100 μl aliquots of cell supernatants were incubated with 50 μl of 1% sulphanilamide and 50 μl of 0.1% N-1- naphtylethylenediamine dihydrochloride in 2.5% H3PO4 at room temperature for 20 min. Absorbance at 540 nm was then measured using an automated Varioskan Ascent plate reader (Thermo Electron) and the presence of nitrite was quantified by comparison with an NaNO2 standard curve.

Evaluation of cytotoxicity against WS1 cell lines

Exponentially growing WS1 cells were plated in 96-well microplates (Costar, Corning Inc.) at a density of 5×103 cells per well in 100 μL of culture medium (DMEM supplemented with 10% foetal bovine serum, vitamins 1X, penicillin and streptomycin) and were allowed to adhere for 16 h before treatment. A concentration gradient of each compound was prepared in biotech DMSO (Sigma–Aldrich) and then diluted in DMEM before it was added to microplates (100 μL per well). Cells were then incubated for 48 h. The final concentration of DMSO in the culture medium was maintained at 0.5% (v/v) to avoid solvent toxicity. As described by O’Brien et al. (2000) (O’Brien et al. 2000), cytotoxicity was assessed using resazurin on an automated Fluoroskan Ascent FLTM plate reader (Labsystems) using excitation and emission wavelengths of 530 and 590 nm, respectively. Fluorescence was proportional to the cellular metabolic activity in each well. Survival percentage was defined as the fluorescence in experimental wells compared to that in control wells after subtraction of blank values.

UVB and IRA stress protection assay

WS1 human skin fibroblast cells were plated in transparent flat bottom 96-well microplates (Greiner, μClear®) at 14 000 cells per well and incubated for 24 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were treated (or untreated) during 20 min with 50 μL of EFPC sample at 100, 50 and 25 μg/ml or positive controls namely, protocatechuic acid, chlorogenic acid and caffeic acid at 5, 15 and 15 μg/ml respectively. Cells were then exposed 4700 mJ/cm2 UVB and incubated for 15 minutes. 50 μl of DHR-123 (1 μg/ml) was added to estimate ROS formed following radiations. After 5 min of incubation, cells were washed with PBS and observed on a cell imaging multimode reader (Citation 3) using excitation and emission wavelength of 507 and 529 nm respectively. The same approach was followed for irradiation with IRA, which was carried out under an infrared water-filtered lamp. The energy received by the cells has been estimated at 5300 mJ/cm2. Green fluorescence was quantified with ImageJ software. Each experiment was carried out in triplicate and the results are representative of at least three different experiments. Statistical analysis was carried out by the Kruskal-Wallis One Way Test followed by post-hoc Student-Newman-Keuls’ test using SigmaStat 3.5 software. P ≤ 0.05 was considered as significantly different.

ÉCHANTILLONAGE ET CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE PRÉLIMINAIRE

Échantillonnage

Les spécimens d’Aralia nudicaulis L. ont été récoltés durant l’été 2016 dans la région du Saguenay-Lac-Saint-Jean, en bordure de forêt du secteur du lac Simoncouche, près de Laterrière (QUÉBEC) (Latitude : 48.2307 ; Longitude : -71.2507). Les rhizomes ont été séchés à température ambiante dans un endroit sombre durant plusieurs semaines avant d’être broyées dans un broyeur mécanique.
Pour les travaux portant sur le dosage de composés d’intérêts au sein des rhizomes d’Aralia nudicaulis au cours de la période de végétation ainsi que pour la standardisation d’extraits, l’échantillonnage a été réalisé de manière plus stricte selon les conditions suivantes. Les rhizomes de six spécimens d’Aralia nudicaulis ont été récoltés dans un quadrat mis en place dans le secteur énoncé précédemment. Les récoltes ont été répétées aux trois différents stades de la période de végétation suivants : floraison (Mai), fructification (Août), préparation pour l’hiver (Octobre). Les rhizomes ont été plongés dans l’azote liquide dès leur récolte pour stopper toute activité cellulaire et ensuite placés au lyophilisateur durant une semaine. Par la suite, des tronçons de 1 cm ont été réduits en poudre à l’aide d’un broyeur à bille à 30 battements par seconde durant 2 minutes. Les échantillons ont toujours été conservés à -15°C.

Extraction et fractionnement

Extraction solide/liquide par chauffage à reflux

L’extraction a été effectuée sur 764 g de rhizomes d’Aralia nudicaulis L. par reflux à l’aide de trois solvants successifs : l’hexane, le méthanol (MeOH), et un mélange méthanol/eau en proportions 30:70 (v/v). Chaque extraction a nécessité un volume de 3L de solvant, pour une durée d’extraction de 1h30, et a été réitérée trois fois pour chacun des solvants. L’utilisation en premier lieu d’un solvant apolaire tel que l’hexane, permet un « dégraissage », enlevant ainsi préalablement la majeure partie des cires, des glycérides et des acides gras de l’extrait souhaité.

Extraction liquide/liquide

Après estimation de la composition par chromatographie sur couche mince (CCM), l’extrait méthanolique des rhizomes d’Aralia nudicaulis L. a été soumis à des extractions liquide/liquide successives. Une masse de 69 g d’extrait méthanolique a été dissoute dans 500 mL d’eau et extraite dans un premier temps six fois avec 500 mL d’acétate d’éthyle (AcOEt), puis dans un second temps, cinq fois avec 500 mL de butanol saturé (BuOH). Au préalable, un mélange BuOH/eau en proportions 3:2 (v/v) a été préparé pour saturer le BuOH en eau avant d’être laissé à décanter durant une nuit. L’extraction à l’aide d’AcOEt et BuOH permet une première séparation de l’extrait MeOH par la différence de polarité de ces deux solvants.
L’ensemble des rendements des extraits bruts et liq/liq sont décrits ci-après (Figure 12).

Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

Tout au long du projet, des suivis par CCM ont été effectués afin d’estimer rapidement la composition d’un extrait ou d’une fraction. Celles-ci ont été réalisées sur des plaques d’aluminium recouvertes d’une couche de 200 μm soit de silice, soit de silice greffée C18 possédant un indicateur UV à λ=254 nm. Divers milieux d’élution ont été mis à l’essai afin d’identifier les conditions d’analyses optimales. Dans la majeure partie des cas, un mélange CHCl3:MeOH:H2O en proportion 26:14:3 (v/v/v) a été utilisé.
Les plaques ont été révélées à l’aide de deux révélateurs différents selon la famille de molécules suspectée. Pour les saponines triterpéniques, une solution d’acide sulfurique (H2SO4) à 20% dans du méthanol a été pulvérisée sur celles-ci pour obtenir des taches de couleur rougeâtre spécifique. Concernant les composés de nature phénolique, une application successive d’une solution de 2-aminoethyl diphenylborinate dissout à 1% dans du méthanol (NP), et de polyéthylèneglycol dissout à 5% dans de l’éthanol (PEG) a été nécessaire. Après révélation, les plaques ont été placées à l’étuve à 100°C pendant 3 à 5 minutes, suite à cela, les plaques ont été observées sous une lampe UV à 365 nm. Des taches colorées spécifiques apparaissent généralement bleues pour les acides phénoliques et jaune-orange pour les flavonoïdes. Les CCM des différentes fractions seront présentées au fur et à mesure du chapitre, en décrivant les milieux d’élution et les révélateurs utilisés.

Bioguidage de l’étude phytochimique

Durant l’intégralité du projet, un suivi des différentes activités biologiques a été effectué afin de guider la poursuite des différents travaux. Les tests effectués visaient à évaluer les activités suivantes : activité cytotoxique, antioxydante et anti-inflammatoire des extraits, des fractions et des composés. Tous les échantillons ont été solubilisés dans du DMSO, en maintenant une concentration en plaque inférieure à 0,5% de ce dernier, afin d’éviter une toxicité liée au solvant.

Activité cytotoxique sur des lignées saines et cancéreuses

Les tests cytotoxiques ont été effectués sur deux lignées de cellules cancéreuses (de poumons A549, et colorectales DLD-1), ainsi que sur une lignée de cellules fibroblastes saines (WS-1) afin d’évaluer la sélectivité des échantillons. Selon le principe de ce test (O’Brien et al. 2000), les échantillons sont d’abord solubilisés à différentes concentrations, puis incubés avec 5000 cellules de chaque lignée pendant 48 heures sous atmosphère humidifiée. Le test s’effectue en deux étapes successives. La première est la mesure de l’activité métabolique par réduction de la résazurine. Ce composé est réduit en résorufine, un fluorochrome dont la fluorescence est mesurée et témoigne ainsi de la viabilité des cellules. La mesure se fait à l’aide d’un lecteur de plaques Fluoroskan Ascent FLTM en utilisant une longueur d’onde d’excitation à 530 nm et une longueur d’onde d’émission à 590 nm. Cependant, un ralentissement métabolique ne traduit pas nécessairement une certaine toxicité pour les cellules cancéreuses. C’est pourquoi un deuxième volet de test est effectué, consistant en un dosage de la mortalité des cellules après retrait des surnageants. Les cellules saines au fond des puits sont lysées au sodium dodecyl sulfate (SDS) à 0,01%, afin d’en libérer le contenu. Le réactif de Hoechst interagi alors avec les brins d’ADN pour créer un complexe fluorescent, qui a été à nouveau quantifié. La mesure est effectuée par un lecteur de plaques Fluoroskan Ascent FLTM, en utilisant une longueur d’onde d’excitation à 355 nm et une longueur d’onde d’émission à 460 nm. Les différentes concentrations des échantillons ont permis d’évaluer leur impact, ainsi que la concentration nécessaire pour inhiber 50% de la croissance cellulaire (IC50). En guise de témoin, chaque analyse a été lancée parallèlement à l’étoposide, un anticancéreux connu.

Activités antioxydantes cellulaire et chimique

L’activité antioxydante est évaluée selon deux types de tests : un test cellulaire et un test ORAC. Les modes opératoires sont décrits dans l’article de K. Lalancette (Girard- Lalancette et al. 2009) avec quelques modifications.
Le test antioxydant sur cellule mesure la capacité antioxydante d’une substance sur des cellules fibroblastes saines (WS-1). Pour cela, des plaques de 96 puits comprenant 10 000 cellules par puits sont ensemencées et incubées à 37 °C en présence de 5% de CO2 sous atmosphère humidifiée. Après 24 heures, les cellules sont lavées avec 150 μL d’une solution tampon de phosphate salin (PBS) à un pH de 7,4, puis remises à incuber durant 30 minutes avec une solution saline isotonique (Hank’s Balanced Salt Solution HBSS) contenant 5 μM de 2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate (DCFH-DA). Ce dernier composé est un fluorochrome permettant de déterminer l’oxydation intra-cellulaire. Les cellules sont ensuite à nouveau lavées avec 150 μL de PBS. Pour obtenir l’activité antioxydante, elles sont ensuite incubées pendant 1 heure avec des concentrations croissantes des composés testés en absence ou en présence de 200 μM de tert-butylhydroperoxide (t-BuOOH). La fluorescence des puits est alors mesurée immédiatement après l’ajout du t-BuOOH, et à nouveau après 90 minutes par un lecteur de plaques Fluoroskan Ascent FLTM, dont les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement 485 nm et 538 nm. Les résultats sont exprimés en IC50, et comparés à trois témoins positifs : la quercétine, le trolox et la catéchine.
Le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), détermine quant à lui la capacité des composés à neutraliser les radicaux péroxyles de la fluorescéine, une sonde fluorescente désactivée après oxydation. Un gradient de 16 concentrations d’échantillons est préparé sans réplications. Les expériences se déroulent à 37,5 °C dans une solution de tampon phosphate 75 mM à pH 7,4, avec un blanc en parallèle. La fluorescence est mesurée par un lecteur de plaques Fluoroskan Ascent FLTM toutes les minutes après l’ajout d’une solution oxydante à 375 μM , le 2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH). L’appareil est réglé avec les mêmes conditions d’utilisation que pour le test antioxydant cellulaire. La cinétique dure au total 60 minutes, puis les résultats sont calculés en comparant les aires sous les courbes de diminution de la fluorescence entre les échantillons et le blanc. Les résultats sont comparés au Trolox comme témoin positif et exprimés en micromoles d’équivalents de Trolox (TE) par milligramme d’échantillon (μmol TE/mg).

Activité anti-inflammatoire sur des macrophages de souris

Le test anti-inflammatoire consiste à mesurer l’inhibition de la production d’oxyde nitrique (NO) synthétisé par des macrophages de souris (RAW 264.7). Le mode opératoire est décrit dans l’article de D. Dufour (Dufour et al. 2007) avec quelques modifications. Des plaques de 96 puits sont ensemencées avec 7,5 x 105 cellules et 100 μL de milieu de culture, puis incubées pendant une nuit à 37 °C en présence de 5% de CO2 sous atmosphère humidifiée.
Les cellules sont ensuite traitées ou non avec des concentrations croissantes d’échantillons, ou avec un contrôle positif de N(ω)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME). La plaque est mise à incuber dans les mêmes conditions que précédemment pendant 24 heures, avant que les cellules soient stimulées avec une solution à 100 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS), dans le but de provoquer une réaction inflammatoire des macrophages et de stimuler la production de NO. Après 24h d’incubation, les surnageants sont récoltés, puis mis au contact du réactif de Griess (Green et al. 1990) qui permet de mettre en évidence la présence de NO par dosage colorimétrique. L’absorbance des puits est enfin mesurée par un lecteur de plaque Varioskan réglé à 540 nm, en comparaison à des standards de nitrite de sodium (NaNO2).
Dans un premier temps, les résultats de tests biologiques, ont permis de sélectionner un extrait brut pour la suite du projet. L’extrait hexane a tout d’abord été mis à l’écart à cause de sa faible quantité. Malgré des résultats légèrement supérieurs de l’extrait MeOH:H20 face à l’extrait MeOH, ce dernier a été choisi pour la suite de l’étude à cause des quantités respectives obtenus après extraction, de 11,91 et 69,95 g. De plus, l’étude qualitative par CCM a démontré une grande quantité de saccharides dans cet extrait aqueux, ceux-ci n’étant pas les composés d’intérêts souhaités pour cette étude.
Cet extrait méthanolique a donc ensuite été soumis à une seconde séparation liquide-liquide, basée sur la différence de polarité des solvants utilisés : acétate d’éthyle (AcOEt), butanol (BuOH) et eau (H2O). Les résultats aux tests antioxydants et anti-inflammatoires mais surtout l’analyse qualitative par CCM (Figure 10) a été primordiale pour déterminer la fraction à utiliser selon les objectifs visés.
La fraction butanolique a été sélectionnée à partir des critères similaires énoncés précédemment, pour l’étude des saponines triterpéniques. Suite à une étude préliminaire par CCM et LC-MS, la fraction BuOH présentait également une plus grande diversité de composés et suggérait une certaine facilité pour l’identification et l’isolation de saponines triterpéniques. Dans un premier temps, un fractionnement bio-guidé a donc été effectué sur l’extrait BuOH à l’aide des différentes méthodes expliquées dans la section suivante (Chapitre 4.2).
La fraction AcOEt, a été quant à elle sélectionnée pour l’étude et l’obtention de fractions enrichies en composés phénoliques grâce à sa grande quantité et diversité en polyphénols.
De plus, l’activité antioxydante avérée, a présenté un grand intérêt, tel que décrit dans l’article scientifique. Les travaux à ce sujet, non-présentés dans l’article, seront décrit dans le chapitre 4.3..

ÉTUDES DES FRACTIONS ENRICHIES EN SAPONINES TRITERPÉNIQUES

Fractionnement de l’extrait BuOH

Chromatographie liquide sur résine diaion HP-20

L’extrait BuOH des rhizomes d’Aralia nudicaulis, a dans un premier temps été fractionné « grossièrement » à l’aide d’une chromatographie liquide sur résine Diaion HP-20 tel que montré à la Figure 14 (A). Cette résine est un polymère de styrène-divinylbenzène sous forme de particules poreuses, allant de 250 à 850 μm, avec des pores d’une grosseur moyenne de 26 nm selon le fournisseur Sigma-Aldrich. Les différents éluants ont été sélectionnés à l’aide de tests de séparation par CCM. Ceux-ci étaient constitués d’un mélange MeOH:H2O allant de 0% à 100% de solvant organique. Les paliers ont été définis selon les extraits traités et à l’aide d’un suivi CCM de la séparation. De plus, les séparations ont été suivies d’un lavage à l’AcOEt ainsi que d’un re-conditionnement de la résine avec de l’eau.

Chromatographie liquide sur gel de silice

Une chromatographie liquide sur gel de silice a ensuite été réalisée sur les fractions F à J obtenues précédemment, pour effectuer un fractionnement plus spécifique, par affinité des composés entre plusieurs phases mobiles de polarités différentes et le gel de silice.
L’éluant optimal utilisé a été un mélange CHCl3:MeOH:H2O en proportion 26:14:3, maintenu de manière isocratique (Figure 14 (B)).
La majeure partie de ces séparations ont été réalisées sur un système de chromatographie liquide à basse pression, équipé d’un détecteur UV ainsi que d’un collecteur de fraction. Les phases stationnaires utilisées étaient des cartouches SiliaSep Flash Cartridge SIlicia du fournisseur SiliCycle ou bien une colonne en verre de 5cm de diamètre pour 46cm de longueur remplie manuellement avec 400g de silice ZEOprep 60 ECO 40-63 μm.

Chromatographie liquide préparative

RP-HPLC-DAD/UV

Afin d’isoler les différents composés triterpéniques ciblés, les fractions sélectionnées ont été fractionnées par chromatographie liquide haute performance préparative. Ce système est relativement similaire au système HPLC analytique à l’exception que les quantités injectables sont plus importantes et que ce procédé permet la collecte de fraction à la sortie de la colonne en se basant sur un mode de détection classique (UV/DAD). Les méthodes sont donc développées et optimisées au préalable sur une HPLC analytique à l’aide d’une colonne similaire mais de dimension réduite. Les éluants utilisés ont été des mélanges d’acétonitrile et d’eau, acidifiés avec 0,1 % d’une solution d’acide formique (HCOOH). Les purifications ont été effectuées sur une colonne Kinetex 5μ XB-C18 (100 Å 250 x 21,20 mm) de chez Phenomenex. Le débit était de 1 mL/min avec des volumes et quantités d’injections variables selon les échantillons.
La longueur optimale l’identification des saponines triterpéniques sur les chromatogrammes est de 207 ± 4 nm (Figure 14 (C)). Cette méthode a permis d’isoler 12 molécules relativement pures. En revanche, les trop faibles quantités obtenues n’ont permis que des élucidations partielles.
Le schéma d’isolation des différents composés purs sont reportés dans la Figure 15.

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

Malgré les faibles quantités, des élucidations partielles ont pu être réalisées à l’aide d’un spectromètre de résonance magnétique nucléaire 400 MHz Bruker. L’appareil a permis l’acquisition de spectres 1D (1H, 13C, DEPT-135, APT, TOCSY) et 2D (1H-1H COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC). Les déplacements chimiques (δ) sont rapportés en parties par million (ppm) et calibrés sur le pic du tétraméthylsilane (TMS).
La RMN, couplée aux données de spectrométrie de masse nous permet de confirmer la présence de glycosides de saponines triterpéniques composés de 2 à 5 unités osidiques reparties sur les positions 3 et 28 de la génine. Les deux différentes génines mises en évidence grâce aux comparaisons avec la littérature sont : l’hédéragénine et l’acide oléanolique. Les signaux associés aux carbones des positions 3 et 28 possèdent un fort déblindage, dû respectivement à la fonction hydroxyle (≈88ppm) et acide carboxylique (≈177ppm). De plus, ces deux aglycones possèdent une insaturation entre les carbones 12 et 13, déblindant considérablement le carbone en position 12 (≈123ppm). L’hédéragénine étant un dérivé de l’acide oléanolique, sa structure possède les mêmes signaux spécifiques que cités ci-dessus.
En revanche la présence de la fonction hydroxyle en position 23, modifie spécifiquement les déplacements chimiques du proton (≈3,72/4,31ppm) et du carbone (≈64,7ppm) considéré.
Les tableaux 15, 16 et 17 présentent les données RMN respectives des trois composés les plus purs, dont les structures ont pu être proposées dans la pyridine. Cependant l’isolation d’une quantité plus importante serait nécessaire pour confirmer ces structures.
Les deux premières structures proposées (Figure 16) sont des glycosides d’hédéragénine. La première structure est glycosylée en position 3 et 28 avec la présence de 2 protons anomériques aux déplacements chimiques respectifs δ 5.33 ppm (d, J=7.3 Hz, 3-OAra) et δ 6.26 ppm (d, J=8.1 Hz, 28-O-Glc). La structure proposée est donc celle de l’hédéragénine-3-arabinosyl-28-glucosyl. Le deuxième composé partiellement identifié, semble correspondre à l’hédéragénine-28-diglucosyl avec des protons anomériques correspondants aux déplacements chimiques suivants : δ 6.26 ppm (d, J=8.0 Hz, 28-O-Glc) et δ 5.04 ppm (d, J=7.8 Hz, Glc-6’-Glc).
Finalement, la troisième structure (Figure 16), supposée être l’acide oléanolique-28-Odiglucoside- 3-glucuronide, a été solubilisée également dans la pyridine. Son spectre 1H a démontré la présence de trois protons anomériques aux déplacements chimiques δ 6.26 (d, J=7.9 Hz, 28-O-Glc), δ 4.71 (d, J=7.7 Hz, Glc-6’-Glc), et δ 3.28 (d, J=5.3 Hz, 3-O-GlcA). Le spectre 13C a révélé un carbone à δ 174.1 ppm qui n’est couplé à aucun proton, ce dernier est caractéristique du groupement acide carboxylique présent sur la position C-6 de l’acide glucuronique.

Fractionnement de l’extrait AcOEt

Fractionnement sur résine diaion HP-

Le but de l’étude portant sur les composés phénoliques dans l’extrait AcOEt était d’identifier et quantifier les composés phénoliques majoritaires ainsi qu’évaluer leur contribution dans les différentes activités biologiques observées. L’extrait AcOEt des rhizomes d’Aralia nudicaulis a dans un premier temps également été soumis à un fractionnement « grossier » à l’aide d’une chromatographie liquide sur résine Diaion HP-20, tel que présenté dans la Figure 18. Les différents éluants ont été sélectionnés à l’aide de tests de séparation par CCM. Ceux-ci étaient constitués d’un mélange MeOH:H2O allant de 0% à 100% avec des mélanges intermédiaires de 20%, 50% et 80% de MeOH. De plus, les séparations étaient suivies d’un lavage à l’AcOEt ainsi que d’un re-conditionnement de la résine avec de l’eau. Par leurs profils chromatographiques très similaires, les fractions 80% et 100% MeOH ont été rassemblées avant d’être analysées (Figure 17). La fraction 50% semble être la fraction la plus enrichie en composés phénoliques. Pour cette raison, la publication traitant de l’activité inhibitrice de la production de ROS se base sur cette fraction enrichie et appelée EFPC.

HPLC couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS)

Tout au long de ce projet, l’analyse des extraits et fractions à l’aide d’un système de chromatographie liquide haute performance, couplé à un spectromètre de masse (RP-HPLCDAD/ UV-ESI-APCI-MS) a été nécessaire pour analyser précisément leurs compositions. Cependant, l’intérêt principal de cette technique dans l’étude des composés phénoliques, était l’identification et la quantification des composés phénoliques majoritaires à l’aide de standards. Le système HPLC-MS utilisé était constitué d’une colonne de type C-18 (Kinetex 5μ XB-C18 100A 250×4.6 mm) achetée de Phenomenex. Les injections s’effectuaient avec des échantillons préalablement filtrés à 0,45 μm pour un volume de 10 μL.
La phase mobile avait pour débit 1 mL/min et était constituée de différents mélanges ACN:H2O ou MeOH:H2O avec une augmentation graduelle du pourcentage en solvant organique. Les longueurs d’ondes d’analyse programmées étaient de 210 ; 254 ; 280 ; 320 ; 365 nm. Suite à des tests préliminaires d’ionisation, le spectromètre de masse a été réglé sur le mode d’ionisation négatif pour l’analyse des composés phénoliques. Grâce à la méthode décrite précedemment, l’identification des 3 composés phénoliques majoritaires et 6 minoritaires a pu être réalisée et confirmée en majorité par l’injection de témoins commerciaux (sauf l’acide p-coumarique) (Figure 19).

Tests cosmétiques

Tests d’inhibition enzymatique

Collagénase

L’évaluation de l’inhibition de la collagénase est effectuée au moyen de « EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit » fournit par Molecular Probes. Pour ce test, un substrat de collagène conjugué à un marqueur fluorescent est utilisé afin de définir l’activité à l’aide de mesures fluorométriques. L’extrait concerné est déposé à 4 différentes concentrations (25, 50, 100 et 200 μg/ml), tandis que la 1,10-phénantroline monohydrate (Sigma-Aldrich, 320056) est utilisée comme contrôle positif (0,063, 0,125, 0,25, 0,5mM). Les échantillons ont été dilués dans du tampon de réaction (Tris-HCl 0.5 M, NaCl 1.5 M, CaCl2 50 mM et azoture de sodium 2 mM; pH 7.6). Ensuite, 20 μl d’une solution de collagène de type 1 conjugué à la fluoresceine (Molecular Probes, D-12060) est ajoutée dans chaque puits. La collagénase de Clostridium (Sigma, C0130) est diluée dans le tampon de réaction pour obtenir une concentration finale de 0,1 U/ml. Un volume de 100 μl de la dilution d’enzyme est ajouté aux extraits et aux contrôles positifs. Le tampon de réaction seul est également ajouté en guise de blanc (100 μl).
Par la suite, les plaques sont incubées à température pièce et à l’abri de la lumière afin de protéger la fluoresceine. Finalement, la fluorescence est mesurée au moyen d’un fluorimètre Varioskan (λ excitation : 495 nm, λ émission : 515 nm). L’activité est mesurée en pourcentage d’inhibition.

Élastase

L’évaluation de l’inhibition de l’élastase est effectuée à partir de la spectrophotométrie en utilisant l’élastase pancréatique porcine et le N-Succ-(Ala)-3-p-nitroanilide (Sigma-Aldrich, S4760) en tant que substrat. Le substrat est dilué dans un tampon Tris-HCl 0,2 M (pH 8) pour obtenir une concentration finale de 1,6 mM. Dans des microplaques à 96 puits, des concentrations finales croissantes d’extraits variant de 12,5 à 100 μg/ml (50 μl par puits) sont préincubées pendant 15 minutes à 25°C avec 75 μl d’élastase (3,33 μg/ml). Chaque extrait est accompagné d’un blanc constitué de tous les éléments excepté l’élastase. L’acide oléanolique est utilisé en tant que contrôle positif à des concentrations similaires à l’extrait. Par la suite, la plaque est incubée durant une période de 10 à 20 minutes à température ambiante. Après l’incubation, 125 μl de substrat sont ajoutés dans tous les puits. Finalement, une lecture de l’absorbance est effectuée sur une période de 20 minutes à 410 nm avec l’aide du spectrophotomètre automatisé Varioskan.

Tests d’immunofluorescence indirecte

Involucrine et Elastine

Pour l’évaluation de la stimulation d’involucrine par l’EFPC, les cellules utilisées sont des kératinocytes HaCaT, tandis que pour l’étude concernant l’élastine, les cellules utilisées sont des fibroblastes WS-1. Celles-ci sont ensemencées à une densité cellulaire d’environ 5000 cellules/puits, incubées au préalable 24 heures à 37°C avec 5% de CO2 pour permettre leur adhérence. Un premier traitement avec un anticorps primaire permet de reconnaître la protéine d’intérêt (Anticorps primaire involucrine : ab28057 lotGR159374-3 1:1000 ; Anticorps primaire élastine : ab21610 lotGR134273-12 1:400). Dans un second temps, un anticorps secondaire conjuguée à un fluorochrome (GFP) vient se fixer sur le premier pour permettre une mesure fluorométrique. L’anticorps secondaire utilisé dans ces travaux est le Alexa fluor 488-conjugated affinipure Goat anti-rabbit lot120234.

CONCLUSION

L’objectif principal du projet, visant à étudier la composition chimique et mieux caractériser l’activité biologique de différents extraits de rhizomes d’Aralia nudicaulis.
Le fractionnement des extraits bruts obtenus ont permis d’enrichir en composés phénoliques certaines fractions telle que la fraction EFPC. L’identification des composés majoritaires, à l’aide d’analyses par HPLC couplée à la spectrométrie de masse, a démontré une grande richesse en acides phénoliques, pouvant en grande partie expliquer les résultats préliminaires concernant l’activité antioxydante et anti-inflammatoire. À la suite de cette identification, il a été postulé que l’acide protocatéchique, l’acide chlorogénique et l’acide cafféique semblaient être de bons candidats pour la détermination de marqueurs chimiques et biologiques. Une méthode a donc été mise en place et optimisée pour la quantification de ces derniers. Cette méthode a été validée en termes de linéarité, précision intra et inter journalière et fiabilité. L’ensemble des paramètres utilisés pour la validation de cette méthode sont en accord avec les instructions de la Conférence International sur l’Harmonisation (ICH).
La quantification de ces trois composés a donc été effectuée à trois stades végétatifs différents d’Aralia nudicaulis L. (rhizomes), afin de confirmer le choix de ces trois acides phénoliques comme marqueurs chimiques. En revanche, l’acide chlorogénique présente des variations de concentrations significatives, ce qui en fait le meilleur candidat en tant que marqueur chimique pour la standardisation d’extraits totaux de rhizomes d’Aralia nudicaulis. Pour les extraits totaux, l’identification de marqueurs biologiques n’a pas été possible à cause des variations non-significatives des activités antioxydantes et anti-inflammatoires désignées.
L’activité biologique, a quant à elle été mise en exergue lors de l’étude de fractions enrichies en composés phénoliques. Des premiers tests préliminaires de criblage ont indiqué des activités antioxydantes et anti-inflammatoires intéressantes pour les fractions riches en composés phénoliques. Pour la fraction EFPC obtenue après fractionnement de l’extrait AcOEt, les activités décrites précédemment étaient couplées à une toxicité très faible voire inexistante envers les fibroblastes de peau humaine. Il a donc été décidé de poursuivre vers des tests cosmétiques spécifiques. À la suite de nombreux tests enzymatiques, tests d’immunofluorescence et tests d’inhibition de la production de ROS, deux activités se sont révélées prometteuses. Il a été observé que l’extrait EFPC inhibe considérablement la production de ROS induite par les irradiations UVB ou IR. De plus, les composés majoritaires seuls ont également été testés et présentent des activités significativement plus faibles que l’extrait complet. Une synergie entre les différents constituants de l’extrait semble être envisageable, des études plus approfondies avec des mélanges de différents ratios en standards commerciaux pourraient être effectuées.
Différents glycosides de saponines triterpéniques de type oléanane ont pu être isolés et partiellement identifiés. Cependant ces élucidations structurales devront être validées à l’aide de quantités plus importantes de composés.
Ce projet constitue donc une avancée dans l’étude phytochimique des rhizomes d’Aralia nudicaulis L. et valide partiellement les vertus ancestrales qui lui sont conférées ou les vertus associées aux espèces phylogénétiquement proches. De plus, une méthode HPLC-MS a été mise au point et validée pour permettre la standardisation d’extraits totaux d’Aralia nudicaulis L.. Toutefois de nombreuses zones d’ombres persistent au sein de cette espèce ainsi qu’aux espèces endémiques du Québec, très peu étudiées et laissant donc de multiples perspectives d’avenir pour leurs études phytochimique et biologique.

Table des matières

RÉSUMÉ 
REMERCIEMENTS 
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES 
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ANNEXES 
CHAPITRE 1 INTRODUCTION 
1.1 Introduction
1.1.1 Objectif général et objectifs spécifiques
1.1.2 Division du mémoire
CHAPITRE 2 REVUE DE LITTÉRATURE
2.1 Des Araliaceae à l’Aralia nudicaulis L
2.1.1 Les ARALIACEAE
2.1.2 Le genre Aralia
2.1.3 L’Aralia nudicaulis L
2.2 Molécules d’intérêts et activités biologiques associées
2.2.1 Les composés phénoliques
2.2.2 Les composés phénoliques dans le genre Aralia
2.2.3 L’activité antioxydante des composés phénoliques
2.2.4 L’activité pro-oxydante liée aux irradiations UVB et IR
CHAPITRE 3 ARTICLE SCIENTIFIQUE 
Aralia nudicaulis L. extract protects Human Skin Fibroblasts against ROS induced by UVB and IRA radiations
Abstract
3.1 Introduction
3.2 Results and discussion
3.2.1 Extraction yield and purification method
3.2.2 Identification and optimization of LC-MS conditions
3.2.3 Quantitative method validation
3.2.4 Quantitative analysis
3.2.5 Biological activities screening
3.2.6 Evaluation of EFPC protection against UVB and IRA radiations
3.3 Materials and Methods
3.3.1 Crude extract and Enriched fraction in phenolic compounds
3.3.2 Standardized extract and standards preparation
3.3.3 Chromatographic instrumentation and conditions
3.3.4 HPLC method validation
3.3.5 Measurement of different biological activities
3.4 Conclusion
References
CHAPITRE 4 RÉSUMÉ DÉTAILLÉ DES TRAVAUX COMPLÉMENTAIRES
4.0 Préambule
SOUS-CHAPITRE 4.1 ÉCHANTILLONAGE ET CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE PRÉLIMINAIRE
4.1.1 Échantillonnage
4.1.2 Extraction et fractionnement
4.1.2.1 Extraction solide/liquide par chauffage à reflux
4.1.2.2 Extraction liquide/liquide
4.1.2.3 Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
4.1.3 Bioguidage de l’étude phytochimique
4.1.3.1 Activité cytotoxique sur des lignées saines et cancéreuses
4.1.3.2 Activités antioxydantes cellulaire et chimique
4.1.3.3 Activité anti-inflammatoire sur des macrophages de souris
SOUS-CHAPITRE 4.2 ÉTUDES DES FRACTIONS ENRICHIES EN SAPONINES TRITERPÉNIQUES
4.2.1 Fractionnement de l’extrait BuOH
4.2.1.1 Chromatographie liquide sur résine diaion HP-20
4.2.1.2 Chromatographie liquide sur gel de silice
4.2.1.3 Chromatographie liquide préparative RP-HPLC-DAD/UV
4.1.2.4 Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
SOUS-CHAPITRE 4.3 ÉTUDES DES FRACTIONS ENRICHIES EN COMPOSÉS PHÉNOLIQUES
4.3.1 Fractionnement de l’extrait AcOEt
4.3.1.1 Fractionnement sur résine diaion HP-20
4.3.1.2 HPLC couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-MS)
4.3.1.3 Tests cosmétiques
CONCLUSION 
Références
ANNEXE I CHROMATOGRAMMES 
ANNEXE II COURBES DE CALIBRATION HPLC 
ANNEXE III ACTIVITÉS BIOLOGIQUES DES EXTRAITS BRUTS

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