EXTRAITS DE FEUILLES DE Kaliphora madagascariensis (KALIPHORACEAE)

Description de Kaliphora madagascariensis

                    Il s’agit d’un genre endémique monotypique représenté uniquement par l’espèce Kaliphora madagascariensis. La plante est un petit arbre atteignant 5 m de haut, dioïque très ramifié. Les feuilles sont alternes, distiques, simples, anisophylles. Celles réduites ressemblent à des bractées subopposées ; les grandes, entières, penninerves, vernissées produisent une forte odeur épicée rappelant le poivre lorsqu’on les froisse et sont capables de provoquer une sensation de brûlure dans le nez. La base des feuilles est généralement asymétrique, les stipules sont nulles. Les inflorescences sont axillaires et légèrement récurvées. Les fleurs sont petites, régulières, tétramères. Elles sont de couleur verte et unisexuée. Les fleurs mâles ont 4 pétales valvaires. Les calices sont cupuliformes à 4 lobes dentiformes. Les fleurs femelles sont sans pétale et ont un ovaire semi-infère. Les lobes du calice qui démarrent juste au-dessous de l’apex de l’ovule sont dentiformes minuscules. Le fruit est une petite drupe charnue, indéhiscente, contenant 2 pyrènes lâchement attachés à un septum central de l’ovaire et renfermant une seule graine. La drupe est de couleur jaune ou orange lorsqu’elle est mûre. Elle est couronnée par les lobes stigmatiques persistants.

Traitement par la chaleur

              L’EB (5 ml) est traité par la chaleur selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.1. (p.10). Un précipité marron se forme. Il est éliminé par centrifugation pendant 5 min à 12 000 tours/min à la moyenne centrifugeuse Jouan (TH 12). Le surnageant inhibe la germination des graines d’oignon. Il constitue l’extrait E1.

Fractionnement par l’acétate d’éthyle

                  L’extrait E1 de volume 20 ml est soumis à un traitement par l’acétate d’éthyle selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.2 (p.11). Une phase aqueuse et une phase organique ont été obtenues. La phase aqueuse (E2) est limpide, de couleur marron, la phase organique (E3) est également limpide et presque incolore. Les deux extraits ont des effets inhibiteurs sur la germination des oignons.  Les résultats du tableau 2 montrent que tous les extraits inhibent la germination des graines d’oignon. Au cours de la purification il y a augmentation du taux d’inhibition. D’après ce tableau, les extraits E2 et E3 provoquent le même taux d’inhibition (90%). Or, la chromatographie sur couche mince (paragraphe 3.4, p 24) révèle que les principes toxiques dans ces deux extraits sont différents. La comparaison de ces résultats à celui d’E1 montre que les molécules chimiques contenues dans E2 et E3 qui ont été séparés à la dernière étape de la purification seraient antagonistes vis-à-vis de l’inhibition de la germination de graines d’oignon.

Effets de l’extrait brut sur les souris

                     Chez la souris, l’administration par voie IP de l’EB à la dose 3,048 g/kg de souris (dose correspondant à la concentration initiale de l’EB, rapport 1/1, P/V), entraine l’apparition des symptômes suivants : juste après l’injection, les souris sont agitées et présentent une contorsion abdominale ; après 5 min, les animaux se déplacent rarement et se regroupent dans un coin ; après 15 min, des convulsions cloniques apparaissent ; après 30 min, la fréquence respiratoire devient très élevée ; après 45 min, les animaux se déplacent à nouveau normalement ; après 1 h, une rémission progressive est observée et les souris reprennent une apparence normale après 6 h.

DISCUSSION ET CONCLUSIONS

                 Ces symptômes d’intoxication suggèrent que les principes toxiques agissent sur le système nerveux. Par ailleurs, l’EB de Kaliphora madagascariensis n’est pas létal. Cependant, à cette dose très élevée, l’extrait peut être considéré comme non toxique (LIETCHFIELD et WILCOXON, 1949 ; HODGH et STERNER, 1943). En outre, ces résultats indiquent que l’EB est moins toxique que ceux de Chassalia bojeriana (RANDRIAMAMPIANINA, 2008), d’Ophiocolea floribunda (RALINORO, 2008) et de Ficus megapoda (RASOLOFOMANANA, 2007), plantes médicinales qui ne provoquent la mort des souris qu’à 2,56 g/kg, 1, 29 g/kg et 1,41g/kg, respectivement. Compte tenu de cette faible toxicité, l’utilisation thérapeutique de la plante pourrait être envisagée moyennant des études spécifiques. Chez les animaux à sang froid, l’extrait brut est toxique sur les têtards de grenouille. La valeur de CL50 n’a pas pu être déterminée car la toxicité de l’extrait de Kaliphora madagascariensis vis-à-vis de ces têtards obéit à la « loi du tout ou rien ». Les larves de moustique sont insensibles à la concentration 2 mg/ml de EB. Ces effets de l’EB sont comparables à ceux de Anacardium occidentale (ABOUBACAR, 2007), Pittosporum senacia (RAZAFINTSALAMA, 2006) et Xylopia humblotiana (RASOLONDRAIBE, 2007) qui sont aussi toxiques sur les têtards de grenouille mais inactifs sur les larves de moustique. L’utilisation de l’extrait de ces plantes en tant que larvicides serait donc inadaptée puisque, non seulement elle exige une forte concentration de l’extrait mais elle pourrait entraîner des conséquences néfastes vis-à-vis d’autres organismes vivants de l’écosystème (têtards de grenouille, ….). Chez les microorganismes testés, seul Escherichia coli s’est montré sensible à l’EB à une concentration de 100 mg/ml. La croissance des autres souches testées n’a pas été affectée dans de telles conditions. Nos résultats ne nous permettent pas de conclure sur l’activité antimicrobienne de l’extrait. Des tests sur d’autres souches sont nécessaires. En résumé, les extraits de Kaliphora madagascariensis sont toxiques sur les végétaux, mais ils agissent aussi sur des animaux à sang froid tels que les têtards de grenouille.

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

            En conclusion, les travaux réalisés sur Kaliphora madagascariensis, une plante endémique et monotypique de Madagascar, bien qu’ils soient préliminaires, ont permis de :
 donner les premières informations sur les propriétés physico-chimiques des principes toxiques présents dans les feuilles ;
 déterminer leur pouvoir toxique sur des organismes végétaux, animaux et microbiens.
Dans l’avenir, nous envisageons :
 d’améliorer les procédés d’extraction et purification afin d’obtenir les principes toxiques à l’état pur ;
 d’étudier les possibilités d’utilisation de la plante en tant qu’herbicide ;
 d’élargir les recherches par la prospection d’autres propriétés permettant de mieux utiliser cette plante ;
 de prospecter leurs effets sur d’autres organismes et de tester la sensibilité d’autres souches microbiennes.

Table des matières

DEDICACE
REMERCIEMENTS
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
ABREVIATIONS
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. CLASSIFICATION
2. DESCRIPTION BOTANIQUE DE LA FAMILLE DES KALIPHORACEAE
3. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DE Kaliphora madagascariensis
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1.MATERIELS
2.1.1. La plante
2.1.2. Utilisations empiriques de la plante
2.1.3. Date et lieu de récolte
2.1.4. Préparation et conservation du matériel végétal
2.1.5. Produits chimiques
2.2.. METHODES
2.2.1. Méthodes d’extraction des principes actifs
2.2.1.1. Extraction à froid
2.2.1.2. Extraction à chaud
2.2.1.3. Extraction des alcaloïdes totaux
2.2.2. Méthodes de purification
2.2.2.1. Traitement par la chaleur
2.2.2.2.Fractionnement par l’acétate d’éthyle
2.2.3. Méthode de concentration
2.2.4. Calcul de rendement
2.2.5. Méthodes d’analyse
2.2.5.1. Criblage phytochimique
2.2.5.1.1. Préparation des extraits à tester
a) Extrait aqueux
b) Extrait hydroéthanolique
c) Extrait chloroformique
d) Extrait acide
2.2.5.1.2. Principes et méthodes
a) Alcaloïdes
Test de MAYER
Test de DRAGENDORFF
Test de WAGNER
b) Désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI)
c) Flavonoïdes et leucoanthocyanes
Flavonoïdes : test de WILSTÄTTER ou test à la cyanidine
Leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH
d) Stéroïdes et triterpènes
Test de LIEBERMANN-BURCHARD
Test de SALKOWSKI
e) Saponosides
f) Tanins et polyphénols
Test à la gélatine
Test à la gélatine salée
Test au chlorure ferrique
g) Iridoïdes
2.2.5.2. Chromatographie sur couche mince
2.2.5.2.1. Principe
2.2.5.2.2. Mode opératoire
a) Dépôt des échantillons
2.2.2. b) Développement du chromatogramme
2.2.3. c) Révélation du chromatogramme
3. RESULTATS
3.1 EXTRACTION
3.1.1 Extraction à froid
3.1.1.1. Extraction aqueuse
3.1.1.2. Extraction hydroéthanolique 75%
3.1.2. Extraction à chaud
3.1.2.1. Extraction aqueuse
3.1.3. Extraction des alcaloïdes totaux
3.2. PURIFICATION
3.2.1. Traitement par la chaleur
3.2.2. Fractionnement par l’acétate d’éthyle
3.3. RENDEMENT
3.4. ANALYSE DES EXTRAITS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
3.5. CARACTERISATION CHIMIQUE
3.5.1. Nature chimique
3.5.2. Propriétés physico-chimiques
4. DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Deuxième partie : ETUDE BIOLOGIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES 
2.1. MATERIELS
2.1.1 Les plantes d’expérimentation
2.1.2 Les animaux d’expérimentation
2.1.2.1. Les animaux à sang chaud : les souris
2.1.2.2. Les animaux à sang froid
2.1.2.2.1. Les larves de moustique
2.1.2.2.2. Les têtards de grenouille
2.1.3 Les matériels de microbiologie
2.1.3.1. Les souches bactériennes
2.1.3.2. Le milieu de culture des microorganismes
2.1.3.3. Les disques pour antibiogramme
2.2 METHODES
2.2.1. Méthode d’étude des effets sur les végétaux
2.2.1.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.1.2. Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.1.2.1. Principe
2.2.1.2.2. Mode opératoire
2.2.1.3. Effets sur le développement des bourgeons axillaires
2.2.1.3.1. Principe
2.2.1.3.2. Mode opératoire
2.2.4. Méthodes d’étude des effets sur les animaux
2.2.4.1. Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang chaud : la souris
2.2.2.1.1. Principe
2.2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2.2. Méthode d’étude des effets sur les animaux à sang froid
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.2.3. Détermination de la CL50 (24 h)
2.2.3 Méthode d’étude des effets sur les bactéries
2.2.3.1. Stérilisation
2.2.3.2. Test en milieu solide
2.2.3.2.1. Principe
2.2.3.2.2. Mode opératoire
3. RESULTATS
3.1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
3.1.1. Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
3.1.2. Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules
3.1.3. Effets sur la croissance des bourgeons axillaires
3.2. EFFETS SUR LES ANIMAUX
3.2.1. Effets de l’extrait brut sur les souris
3.2.2 Effets de l’extrait brut sur les animaux à sang froid
3.2.2.1. Effets de l’extrait brut sur les têtards de grenouille
3.2.2.2. Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique
3.3. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES BACTERIES
4. DISCUSSION ET CONCLUSIONS
CONLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME

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