Table des matières
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
CONTEXTE
CHAPITRE I – INTRODUCTION
I.1 Contexte de l’étude : l’accident nucléaire de Fukushima
I.1.1 Problèmes écologique et économique : bilan et état des lieux
I.1.2 Mesures mises en place pour la gestion du risque
I.2.Le césium
I.2.1. Les différentes formes de césium
I.2.2. Les utilisations courantes du césium
I.2.3. La contamination par le césium
I.3. Le riz
I.3.1. Importance
I.3.2 Origine et diversité
I.3.3 Le génome du riz
I.3.4 Développement et reproduction
I.3.4 Systèmes de culture
I.4. L’architecture racinaire
I.4.1. Mise en place et développement du système racinaire
I.4.2. Plasticité et diversité du système racinaire
I.4.3. Phénotypage du système racinaire
I.4.4. Bases génétiques de l’architecture du système racinaire
I.5. Absorption d’ions par les racines
I.5.1. Principes généraux
I.5.2. Rôle du potassium et son transport chez les plantes
I.5.3. Transport du césium chez les plantes
I.5.4. Systèmes de transport perméables à K+, potentiellement perméables à Cs+
I.5.4.1. Description des canaux Shakers
I.5.4.2. Description de la famille HKT/TRK
I.54.3. Description de la famille HAK/KUP/KT 7
I.6. Présentation du sujet de thèse
CHAPITRE II-MATERIEL ET METHODES
II.1 Matériel végétal
Lignées porteuse d’une insertion ADN-T dans le gène DRO1
Lignée isogénique IR64 NIL DRO1
Autres variétés utilisées dans notre étude
II.2 Méthodes de culture du riz
II.2.1 Culture en terrines
II.2.2 Culture en pots individuels
II.2.3 Culture hydroponique
II.2.4 Culture in vitro en boîtes de Petri carrées
II.2.5 Culture des plantes sur la plateforme de phénotypage racinaire (Rhizoscope)
II.2.6 Culture des plantes sur sol de rizière en tubes PVC pour le traitement Césium
II.2.6.1 Contamination et équilibrage des horizons du sol
II.2.6.2 Conditions de culture
II.2.6.3 Mesures des paramètres morphologiques et physiologiques des plantes
II.3 Transformation du riz via Agrobacterium tumefaciens
II.3.1 Etape d’induction des cals de riz à partir du scutellum d’embryon mature
II.3.1.1 Stérilisation des grains
II.3.1.2 Induction des cals
II.3.2 Etape de co-culture avec Agrobacterium tumefaciens
II.3.2.1 Préparation des agrobactéries
II.3.2.2 Co-culture des agrobactéries avec les cellules de riz
II.3.2.3 Première étape de sélection des cals résistants
II.3.2.4 Seconde étape de sélection des cals résistants
II.3.2.4 Etape de régénération des cales en jeunes plantules
II.3 Mutagenèse du riz par la technologie CRISPR/Cas9
II.4 Biologie moléculaire
II.4.1 Extraction d’ADN nucléaire
II.4.1.1 Méthode MATAB (Gawel et Jarret, 1991)
II.4.1.2 Extraction d’ADN à l’aide du tampon de dilution du Phire® Plant Direct PCR Kit
II.4.2 Extraction de l’ADN plasmidique
II.4.3 Préparation des ADNc
II.4.3.1 Extraction d’ARN de pointes racinaires
II.4.3.2 Rétro-transcription
II.5 Méthodes d’analyse des acides nucléiques
II.5.1.1 Migration des acides nucléiques par électrophorèse
II.5.1.1 Analyses des fragments d’ADN sur gel d’agarose par électrophorèse
II.5.1.2 Gel d’électrophorèse des ARN
II.6 Les différentes PCR
II.6.1 PCR « classique »
II.6.2 La Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
II.6.3 La RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
II.7 Méthodes de clonage
II.7.1 Les enzymes de restriction
II.7.3 Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur plasmidique par clonage
II.8 Caractérisation phénotypique des lignées
II.8.1 Réponse gravitropique de la racine séminale
II.8.2 Mesures des contenus en Cs+ et K+
II.8.2.1. Extraction et dosage de cations
II.8.2.2 Détermination de la concentration en cation d’un échantillon
II.8.3 Cinétique d’influx de K+ et de Cs+ in planta
II.8.4 Accumulation de K+ et de Cs+ in planta après différents traitements
II.9 Expérimentations en levures
II.9.1 Milieux de culture des levures
II.9.2 Transformation des levures
II.9.3 Insertion de mutations aléatoires
II.9.4 Criblage de mutants de levures
II.9.5 Les tests en gouttes
II.9.6 Cinétiques d’influx de K+ en levures
II.9.7 Cinétiques d’influx de Cs+ en levures
II.9.8 Cinétiques d’accumulation de Cs+ en levures
II.9.9 Extraction d’ADN plasmidique des levures
PARTIE I- Rôle du gène OsHAK1 dans le transport de K+ et de Cs+
CHAPITRE III- Identification d’un système de transport majeur d’absorption du Cs+ en présence de faibles concentrations chez le riz
III.1 Introduction
III.2 Analyse de la perméabilité à Cs+ de transporteurs de la famille HKT
III.2.1 Perméabilité à Cs+ d’OsHKT2;1, OsHKT2;2 et OsHKT2;4 dans l’ovocyte de xénope
III.2.2 Comparaison de l’absorption racinaire de Cs+ chez Nipponbare, Pokkali et Nona Bokra résentant des différences d’équipement en transporteurs HKT de types 2;1/2;2
III.2.3 Analyse du rôle d’OsHKT2;1 dans l’absorption de Cs+ par la racine de riz à l’aide d’une lignée mutante perte de fonction
III.3 Choix du transporteur d’intérêt au sein de la famille HAK/KUP du riz: Analyse des deux transporteurs majeurs OsHAK1 et OsHAK5
III.3.1 Analyse de la perméabilité à Cs+ d’OsHAK1 et d’OsHAK5 exprimés dans la levure
III.3.2 Sélection de lignées insertionnelles pertes de fonction pour OsHAK1 et OsHAK5
III.3.3 Comparaison du rôle d’OsHAK1 et d’OsHAK5 dans l’absorption de Cs+ par la racine de riz
III.4 Discussion
CHAPITRE IV- Production de lignées mutantes pertes de fonction pour OsHAK1 par la technologie Crispr-Cas9
IV.1 Introduction : Utilisation de la technologie CRIPR-Cas9 pour l’inactivation ciblée de gènes
IV.2 Choix des séquences cibles
IV.3 Clonage des sgRNA et transformation
IV.4 Evaluation des plantes T0 transformées
IV.4.1 Analyse par q-PCR du nombre de transgènes
IV.4.2 Analyse des mutations dans le gène OsHAK1
IV.4.3 Croissance et fertilité des lignées Crispr-Cas9
IV.5 Discussion
CHAPITRE V- Rôle du gène OsHAK1 dans l’absorption de K+ et de Cs+ chez le riz
V.1 Présentation de l’article
V.2 Article
CHAPITRE VI- Production de variants d’OsHAK1 avec une perméabilité K+/Cs+ améliorée
VI.1 Introduction
VI.2 Génération de mutants d’OsHAK1 par mutagénèse aléatoire
VI.3 Criblage des mutants dans la levure
VI.3.1 Criblage de mutants moins sensibles à Cs+ par tests en gouttes
VI.3.2 Validation des mutants sélectionnés : analyses de leurs cinétiques de transport de K+ et Cs+
VI.3.3 Caractérisation moléculaire des mutants sélectionnés
VI.4 Edition du gène OsHAK1 par la technique Crispr-Cas9
VI.5 Discussion
PARTIE II- Influence de l’architecture racinaire sur le prélèvement en césium dans les couches superficielles du sol
CHAPITRE VII- Caractérisation des lignées affectées dans le gène DRO1
VII. 1. Introduction
VII.2 Caractérisation moléculaire de la lignée AVRE12
VII.2.2 Analyses de la courbure gravitropique
VII.3 Analyse de l’architecture racinaire au rhizoscope
VII.3.1 Analyse de l’architecture racinaire des variétés
VII.3.2 Analyse de l’architecture racinaire des lignées dro1 et NIL DRO1
VII.3.3 Conclusion
CHAPITRE VIII- Influence de l’architecture racinaire sur l’absorption de césium disposé dans les couches superficielles du sol
VIII.1 Introduction
VIII.2 Première expérimentation en tubes PVC
VIII.2.1 Mise en place et ajustement du dispositif
VIII.2.2 Collecte des échantillons
VIII.2.3 Analyses des différents paramètres de biomasse Appareil aérien
Biomasse de la partie racinaire
VIII.2.4 Analyses des teneurs en Cs+ dans les différents tissus 8
Teneur en Cs+ des parties aériennes
Teneur en Cs+ des parties racinaires
VIII.2.5 Conclusions
VIII.3 Seconde expérimentation en tubes PVC
VIII.3.1 Mise en place du dispositif
VIII.3.2 Indicateurs physiologiques
VIII.3.3 Analyses des différents paramètres de biomasse
Biomasse de la partie aérienne
Biomasse de la partie racinaire
VIII.3.4 Analyses des teneurs en Cs+ dans les différents tissus
Teneur en Cs+ dans les parties aériennes
Teneur en Cs+ dans les parties racinaires
CHAPITRE IX- Effet de la diversité d’architecture racinaire sur l’accumulation de Cs+ : Discussion
CHAPITRE X : Conclusions et perspectives
ANNEXES
Annexe 1 : Amorces de génotypage, de RT-PCR et de qPCR
Annexe 2 : Amorces utilisés pour la création des lignées Crispr affectées dans le gène OsHAK1.
Annexe 4 : Milieux de culture des Levures
Annexe 5 : Milieux de transformation du riz
Annexes 6 : Schéma de randomisation des lignées sur le dispositif de phénotypage
REFRERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
