LLLALI
Chromatographie sur colonne (CC)
Comme toutes les chromatographies couramment employées, à l’analyse et à la séparation de très faibles quantités de produits, la chromatographie sur colonne peut être utilisée comme une méthode préparative car elle permet en effet de séparer les constituants d’un mélange, les isoler à partir de l’échantillon dont la masse pourrait atteindre plusieurs grammes. Elle présente cependant plusieurs inconvénients :
de grandes quantités de solvant sont nécessaires à l’élution ;
la durée de l’élution est généralement très longue ;
la collecte des fractions exige une attention constante.
Elle est adaptée à la purification de faibles quantités de produits, lorsque les conditions opératoires sont au point. Cette technique est aussi basée sur des phénomènes d’adsorption. La silice est l’adsorbant le plus souvent utilisé. La colonne, de longueur et de section bien définie, est remplie avec le mélange adsorbant/éluant. La solution concentrée d’échantillons est déposée en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de l’écoulement continu de l’éluant, traversant la colonne par gravité ou sous l’effet d’une faible pression. On peut utiliser comme éluant un solvant unique ou bien accroître progressivement la polarité de l’éluant de façon à accélérer le déplacement des composés. Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l’absorbant et leur solubilité dans l’éluant. Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones cylindriques qui se séparent en migrant vers le bas. A mesure que chaque zone s’écoule de la colonne, on la recueille. La résolution chromatographique dépend de quatre facteurs :
– l’adsorbant
– l’éluant
– la dimension et longueur de la colonne
– la vitesse d’élution
LA RESONANCE MONODIMENSIONNELLE (RMN– 1D)
a) RMN proton (RMN – 1H) : Le spectre de la RMN proton les caractéristiques suivantes : La zone de balayage par impulsions du spectre correspond au domaine de déplacement chimique δ compris entre 0 et 15 ppm. Les signaux du spectre peuvent se présenter sous forme de singulet, de doublet, de triplet, de quadruplet ou de multiplet. L’intensité des signaux multiplets suit la répartition selon le triangle de Pascal. La courbe d’intégration du spectre qui se présente sous forme de palier, permet de calculer le nombre de protons correspondants à chaque signal.
b) RMN 13C – 1D : Le spectre de la RMN du Carbone 13 monodimensionnel est caractérisé par: Le domaine de balayage par impulsion couvre la zone de déplacement chimique compris entre 0 et 250 ppm Les signaux dans le spectre de la RMN 13C se présentent sous forme de raies. En Broad Band de coupling (BB), le nombre des raies est égal au nombre des atomes de carbones de la molécule s’il n’y a pas de symétrie moléculaire ou superposition des signaux de carbones. Par ailleurs, la technique d’enregistrement off-résonance (OR), tous les couplages sont éliminés sauf les couplages entre carbone et hydrogène directement lié. Les signaux obtenus se présentent sous forme de singulet s’il s’agit d’un carbone quaternaire Cq, sous forme de doublet pour un carbone du type CH, sous forme de triplet pour le carbone du type CH2 ou sous forme de quadruplet dans le cas où le carbone du type CH3. Cette multiplicité des signaux de carbone en off résonance est régit par la règle de (2n I + 1) où n est le nombre de proton porté par le carbone, I nombre de spin qui est égale à 1/2 pour les 1H et 13C. Cette règle de multiplicité devient alors : (n + 1). En effet, pour un atome de carbone relié avec 2 atomes d’hydrogènes, on a : n = 2 et la règle de multiplicité donne : (2n I + 1) = (n + 1) = (2 + 1) = 3 Ce qui donne donc un signal triplet. Les expériences de la RMN utilisant le balayage par impulsions ont contribuées largement à l’amélioration des spectres obtenus. En effet, la résolution spectrale devient de plus en plus élevée ce qui permet par exemple de distinguer deux signaux de carbones dont les déplacements chimiques sont très proche l’un de l’autre. Pour appuyer les informations spectrales provenant du spectre de la RMN-1D-13C, une des techniques spectrales la plus exploitées actuellement c’est le spectre du type DEPT. DEPT (distorsionless Enhancement by Polarization Transfer) Dans cette expérience, les carbones quaternaires sont absents du spectre et les CH2 sont orientés en bas et les CH et CH3 sont dirigés vers le haut. La technique d’enregistrement ATP est une alternative de cette technique spectrale DEPT. APT (Attacement of Polarization Transfert) Pour le spectre APT, contrairement au spectre DEPT, les CH2 sont orientés vers le haut alors que les carbones quaternaires sont désormais visibles.
La cueillette et le choix de la plante
La cueillette a été effectuée dans la forêt d’Ambodirotra, commune rurale de Lohariandava, district de Brickaville, région ATSINANANA (Toamasina). C’est une forêt de basse altitude. C’est grâce à la volonté de Monsieur BELAKA, Tangalamena (Doyen) de ce village que nous avons pu récolter quelques variétés de plantes médicinales très utilisées dans cette région. Après avoir préparé les herbiers de référence de chaque variété destinées pour l’identification botanique au parc botanique et zoologique de Tsimbazaza, les plantes sont séchées à l’abri du soleil. Parmi ces plantes, la plante dénommée LAZ a été choisie en tenant compte de sa chimiotaxonomie et de la pharmacopée traditionnelle.
Spectre de la RMN 13C – 1D Broad Band
Le spectre de la RMN-13C-1D Broad band, découplé de tous les couplages des protons présente 31 signaux, outre les signaux assignés aux solvants CDCl3 (3 pics) et CD3OD (7 pics). Cette information nous indique alors que la substance contient 31 carbones. La majorité des signaux de THTL1 se trouve entre 100 et 170 ppm. Ce qui nous laisse supposer que la substance THTL1 possède plusieurs insaturations. En effet, une vingtaine de ces signaux de carbone se situent dans le domaine des carbones insaturés ou aromatiques. Pour faciliter l’analyse du spectre de la RMN-1D-13C Broad Band de THTL1, nous avons numéroté tous les signaux du spectre de la RMN du champ faible au champ fort (à partir du gauche vers la droite).
CONCLUSION
Les feuilles de la plante LAZ de la famille des Rubiaceae ont fait l’objet de nos investigations chimiques. L’enquête ethnobotanique effectuée nous a informé que le décocté des feuilles de la plante est utilisé pour guérir différentes maladies entre autres le maux d’estomac, la fatigue générale, ….. Les extraits hexanique, chloroformique, acétate d’éthyle et hydroalcoolique de la plante ont été obtenus moyennant la technique physico-chimique de l’extraction à reflux par solvants de polarité croissante. Le screening phytochimique effectué sur les quatre extraits de LAZ montre la présence majoritaire d’alcaloïdes, de térpénoïdes, de stéroïdes, des flavonoïdes, des tanins et des saponosides La chromatographie sur colonne de l’extrait chloroformique nous a permis d’isoler deux produits purs THLT1 et THLT2. Les analyses approfondies des spectres de la RMN-1D-1H, de la RMN-1D-13C BB et DEPT et de la RMN-2D : COSY, HMQC, HMBC ont abouti à la structure indolique de la molécule THLT1. La libre rotation de la molécule au niveau de la liaison C-24 – C-25, nous a permis d’expliquer la présence de quatre signaux anormaux C-4’, C-6’ , C-14’ et C-10’’ qui sont attribués aux signaux de carbones influencés par la liaison hydrogène qui s’effectue entre l’oxygène du carbonyle et l’hydrogène de l’azote de l’indole. Cette molécule THLT1 de formule brute C27H30N2O9, a une masse moléculaire égale à 526. Le nombre d’insaturations ainsi que le nombre d’hétéroatomes comme les oxygènes ou les azotes présents dans THTL1, sont des critères nous permettant de prévoir que THTL1 pourrait probablement être doué d’activité cytotoxique intéressante. C’est dans ce sens, que nous projetons de continuer les investigations chimiques de cette plante en isolant d’autres métabolites et de déduire leurs activités biologiques et d’étudier les relations structure-activité des molécules isolées.
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I : RAPPELS THEORIQUES
A. METHODES PHYSICO-CHIMIQUES
1. Test phytochimique
a) Test des alcaloïdes
b) Test des stéroïdes et terpénoïdes
c) Test des flavonoïdes
d) Test des tanins et des polyphénols
e) Test des sucres réducteurs et des polysaccharides
f) Test des saponines
2. EXTRACTIONS
a) Extraction solide-liquide
b) Extraction liquide-liquide
3. CHROMATOGRAPHIE
a) Définition de la chromatographie
b) Principe de la chromatographie
c) Chromatographie sur couche mince (ccm)
d) Chromatographie sur colonne (CC)
B. METHODES SPECTRALES
1. LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN)
a) Principe de la RMN
b) Appareil RMN à onde continue
c) Appareil RMN à impulsions
d) Déplacement chimique
e) Différence entre RMN solide, liquide, gaz
f) Solvant employé en RMN
g) Les références en RMN
2. LA RESONANCE MONODIMENSIONNELLE (RMN– 1D)
a) RMN proton (RMN – 1H)
b) RMN 13C – 1D
3. LA RESONANCE BIDIMENSIONNELLE (RMN – 2D)
a) Les spectres de 1H – 1H COSY (Correlated Spectroscopay)
b) Le spectre HMQC (Heteronuclear Multiple Bound Correlation)
c) Le spectre HMBC (Heteronuclear Multiple Bound Correlation)
C. GENERALITES BOTANIQUES
1. La famille RUBIACEAE
a) Classification classique de RUBIACEAE
b) Classification phylogénétique
2. Exemple du genre Pauridiantha
PARTIE II : PARTIE EXPERIMENTALE
A. EXTRACTIONS ET ISOLEMENTS DES MOLECULES
1. PREPARATION DE LA MATIERE VEGETALE
a) La cueillette et le choix de la plante
b) Le séchage et le broyage
2. SCREENING PHYTOCHIMIQUE
a) Protocole du screening phytochimique
b) Résultats du screening phytochimique
3. EXTRACTIONS ET ISOLEMENTS DES MOLECULES PROPREMENT DITE
a) Extractions
b) Isolements des molécules
4. PURIFICATION DE CES PRODUITS LT2- D223 ET LT2 – D222
a) Purification de LT2- D223
b) Purification de LT2-D222
B. DETERMINATION DE STRUCTURE
1. ANALYSE DU SPECTRE DE LA RMN – 1D DE THLT1
a) Spectre de la RMN 13C – 1D Broad Band
2. ANALYSE SPECTRALES DE LA RMN – 2D DE THLT1
a) RMN – 2D HMQC DE THLT1
b) RMN – 2D COSY 1H – 1H de THLT1
c) RMN – 2D HMBC de THLT1
3. EDIFICATION DE LA STRUCTURE DE THLT1
a) Connections du fragment 1 avec le fragment 2
b) Connections entre fragment 2 et fragment 3
c) Connections du fragment 4 avec le fragment 3
PARTIE III : CONCLUSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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