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Les transcrits par l’ARN Pol III
Les gènes transcrits par l’ARN Pol III sont appelés « gènes de classe III ». L’ARN Pol III transcrit des petits ARN non traduits, d’une taille généralement inférieure à 400 pb. Ces nombreux ARN interviennent dans des voies métaboliques fondamentales à la cellule, notamment la traduction des ARNm et la maturation des ARN. L’ARN Pol III transcrit également une variété de petits ARN de fonction encore inconnue (pour revues White, 2008 ; Dieci et al., 2007).
Parmi les transcrits synthétisés par l’ARN Pol III, on trouve en tout premier lieu les ARN de transfert (ARNt). Les ARNt sont les adaptateurs qui, au cours de la traduction, font correspondre un codon, séquence de trois bases, de l’ARNm à l’un des 20 acides aminés qui doit être incorporé à la chaîne polypeptidique naissante : les ARNt portent un anticodon, séquence de trois bases qui s’apparie au codon, et un acide aminé spécifique à l’anticodon. Les cellules eucaryotes utilisent 40 à 50 ARNt différents. En effet, la dégénérescence du code génétique explique l’existence de plus de 20 ARNt (à un acide aminé peut correspondre plus d’un codon), mais leur nombre n’atteint pas les 64 possibilités d’ARNt (4 bases possibles à chaque base du codon, soit 43) à cause du wobble, un mode d’appariement bancal qui permet à l’anticodon d’un ARNt de reconnaître plusieurs codons synonymes (correspondant au même acide aminé). De plus, étant donné la redondance des gènes spécifiant chaque ARNt, le nombre de gènes d’ARNt est considérablement plus important. Ainsi, la levure Saccharomyces cerevisiae possède 275 gènes d’ARNt (Goffeau et al., 1996 ; Percudani et al., 1997). Ils sont dispersés sur tout le génome, mais semblent transcrits en foyers à proximité du nucléole (THOMPSON et al. 2003).
Un autre petit ARN transcrit par l’ARN Pol III et participant à la traduction est l’ARNr 5S.
L’ARNr 5S, spécifié par le gène RDN5, est composant de la grande sous-unité ribosomique. Chez S.cerevisiae, RDN5 est présent en 100 à 200 copies localisées au sein des répétitions d’ADNr du 35S elles-mêmes transcrites au nucléole par l’ARN Pol I. (Nath and Bollon, 1977; Elion and Warner, 1984).
Il existe d’autres transcrits synthétisés par l’ARN Pol III qui sont également incorporés dans des complexes ribonucléoprotéiques. Parmi eux, on trouve :
• l’ARN 7SL (gène SCR1), composant de la particule de reconnaissance du signal (SRP) qui est impliquée dans l’adressage des protéines au réticulum endoplasmique. Avec ses 522 nucléotides (contre en moyenne 80 nucléotides pour un gène d’ARNt), SCR1 est le plus long gène de classe III (Felici et al., 1989).
• l’ARNsn U6 (gène SNR6) intégré au spliceosome, le complexe assurant l’épissage des ARNm (Kunkel et al., 1986).
• l’ARN H1 (gène RPR1) intégré à la RNase P, une enzyme impliquée dans la maturation de l’extrémité 5’ des ARNt (Lee et al., 1991).
De manière remarquable, ces ARN sont essentiels à la viabilité cellulaire et participent à l’activité catalytique des complexes ribonucléoprotéiques dans lesquels ils sont retrouvés (Guerrier-Takada et al., 1983 ; Nissen et al., 2000).
Chez l’homme, d’autres ARN supplémentaires sont transcrits par l’ARN Pol III comme c’est le cas de l’ARN 7SK, impliqué dans la régulation de la transcription par l’ARN Pol II (pour revue, Diribarne et al., 2009), ou de la composante ARN de la RNase MRP. C’est le cas également des éléments SINE (Short Interspersed Nuclear Element) et des ARN vaults, dont la fonction exacte reste méconnue. Enfin, certains ARN viraux sont également transcrits par l’ARN Pol III : les ARN VAI et VAII de l’adénovirus et EBER1 et EBER2 du virus d’Epstein-Barr sont transcrits par l’ARN Pol III de la cellule hôte au cours de l’infection virale.
L’analyse relativement récente de l’occupation de la machinerie de transcription par l’ARN Pol III sur le génome de plusieurs organismes différents a conduit à l’identification de nouveaux ARN transcrits par l’ARN Pol III (Harismendy et al., 2003 ; Isogai et al., 2007 ; Roberts et al., 2003 ; Moqtaderi et al., 2004 ; Pagano et al., 2007 ; Dieici et al., 2007). L’évolution des technologies a même permis de séquencer directement l’ADN sur lequel les éléments de la machinerie de transcription pouvaient se lier (Canella et al., 2010 ; Barski et al., 2010 ; Moqtaderi et al., 2010 ; Raha et al., 2010 ; Oler et al., 2010). Les potentiels nouveaux gènes transcrits par l’ARN Pol III sont actuellement à l’étude.
Les composants de la machinerie de transcription par l’ARN Pol III
La transcription par l’ARN Pol III nécessite, en plus de la Pol elle-même, des facteurs d’initiation de la transcription : TFIIIA, TFIIIB et TFIIIC. Ces facteurs sont indispensables pour transcrire spécifiquement les gènes concernés. Ils sont nécessaires à l’étape de pré-initiation pour pouvoir initier correctement la transcription.
Ces facteurs de transcription ont été identifiés lors de fractionnements protéiques réalisés à partir d’extraits de cellules humaines (Segall et al., 1980) et d’autres organismes dont la levure (Klekamp et Weil, 1982). La transcription reconstituée in vitro nécessitait, en plus de l’ARN Pol III, les trois fractions protéiques contenant les activités de TFIIIA, TFIIIB et TFIIIC. Ces facteurs sont nécessaires et suffisants pour initier correctement la transcription par l’ARN Pol III mais il n’est pas exclu que les fractions protéiques contiennent d’autres constituants non essentiels impliqués dans la transcription (Andrau et Werner, 2001 ; Kassavetis et Steiner, 2006).
Afin de mieux comprendre la fonction de chacun des facteurs de transcription, il sera nécessaire d’aborder au préalable la classification des promoteurs des gènes de classe III : en effet leur structure détermine les composants indispensables de la machinerie de la transcription par l’ARN Pol III. Nous verrons ensuite la description de l’ARN Pol III et de chacun des facteurs de transcription TFIIIA, TFIIIB et TFIIIC.
La structure du promoteur du gène transcrit détermine les facteurs de transcription recrutés
L’ensemble des facteurs de transcription recrutés sur les gènes transcrits par l’ARN Pol III varie en fonction du promoteur du gène considéré. Les promoteurs des transcrits par l’ARN Pol III ont une structure discontinue et peuvent être regroupés dans trois catégories distinctes (figure 2 ; pour revue, Scramm et Hernandez, 2002 ; Huang et Maraia, 2001).
Le promoteur de type 1, promoteur du gène de l’ARNr 5S, se situe dans la région codante du gène. Il se compose d’une boîte A suivie d’un élément intermédiaire puis d’une boîte C. La distance séparant les boîtes A et C est déterminante (environ 20 pb) pour l’efficacité de la transcription. Sur ce type de promoteur, le facteur TFIIIA se fixe d’abord sur la boîte C. Ensuite, TFIIIA recrute le facteur TFIIIC lequel recrute à son tour TFIIIB. Enfin, l’ARN Pol III complète ce complexe de préinitiation sur le promoteur du gène et amorce l’initiation de la transcription.
Le promoteur de type 2 concerne notamment les gènes codant pour les ARNt, l’ARN 7SL et des gènes viraux. Il est également situé dans la région transcrite du gène et est caractérisé par la présence de deux boîtes A et B. L’efficacité de la transcription dépend fortement de la nature de ces séquences. Pour ce type de promoteur, le facteur TFIIIC se lie directement aux boîtes promotrices internes. Ensuite, TFIIIB puis l’ARN Pol III sont recrutés sur le gène.
Chez l’homme, le promoteur de type 3, concernant le gène de l’ARNsn U6, se compose d’un élément distal (Distal Sequence Element, DSE) localisé très en amont du site d’initiation de la transcription, d’un élément proximal (Proximal Sequence Element, PSE) et d’une boîte TATA situés juste en amont de la région transcrite. Chez S. cerevisiae, le promoteur du gène de l’ARNsn U6 est mixte : il consiste en éléments internes et externes à la région codante du gène (boîte A notamment, de manière comparable aux promoteurs de type 2, et boîte TATA). Sur la séquence PSE est recruté le complexe SNAPc (snRNA activating protein complex, également appelé PSE transcription factor (PTF) ou PSE-binding protein (PBP)), tandis que parallèlement est recruté le facteur d’activation Oct-1 sur la séquence DSE. Ensuite une sous-unité du facteur TFIIIB, TBP (TATA box binding protein), est recrutée sur la boîte TATA. Une fois le facteur TFIIIB en place, l’ARN Pol III est recrutée.
Les facteurs de transcription des gènes de classe III
Au cours d’une transcription in vitro, l’ARN Pol III purifiée est capable de terminer correctement la synthèse de l’ARN (Cozzarelli et al., 1983). Cependant, elle ne parvient pas à réaliser seule la transcription spécifique d’un gène : l’ARN Pol III ne possède pas de capacité intrinsèque de reconnaissance des promoteurs décrits précédemment. Chez Saccharomyces cerevisiae, l’initiation précise de la transcription est en effet dépendante des facteurs de transcription TFIIIC, TFIIIB et, dans le cas de la transcription de l’ARNr 5S, de TFIIIA. Dans cette partie, nous nous intéressons plus particulièrement aux facteurs de transcription TFIIIA, TFIIIC et TFIIIB décrits chez la levure S. cerevisiae.
Le facteur TFIIIA
Le facteur TFIIIA (50 kDa chez S. cerevisiae) est une protéine spécifique à la transcription du gène de l’ARNr 5S (RDN5). Son rôle est celui d’un adaptateur, intermédiaire ente le facteur TFIIIC et le promoteur spécifique du gène RDN5.
TFIIIA a été le premier facteur de transcription purifié grâce à sa grande abondance dans les œufs de xénope (Engelke et al., 1980). Il est essentiel à la viabilité de la levure. TFIIIA est peu conservé au cours de l’évolution avec moins de 20 % d’identité de séquence avec celle de son homologue amphibien (Archambault et al., 1992).
TFIIIA se lie à la boîte promotrice C du gène de l’ARNr 5S et est de ce fait indispensable à sa transcription (Camier et al., 1995). Le facteur TFIIIA contient neuf doigts de zinc chez S. cerevisiae qui lui permettent de se lier à l’ADN (Gaskins et Hanas, 1990). Les doigts de zinc 1 et 7 de TFIIIA interviennent spécifiquement dans le recrutement de TFIIIC (Rothfels et al., 2007).
Le facteur TFIIIC
Chez S. cerevisiae, le facteur TFIIIC (600 kDa) est composé de six sous-unités. Ce complexe protéique est également essentiel à la viabilité de la levure. TFIIIC reconnaît à la fois le complexe TFIIIA-RDN5 (lorsque TFIIIA est lié au promoteur du gène RDN5) et les boîtes A et B des promoteurs de type 2.
Chez la levure, des études de protéolyses ménagées de ce facteur de transcription ont montré l’existence de deux domaines nommés τA et τB (Marzouki et al., 1986).Ces deux entités sont visibles sous forme de deux particules globulaires associées en microscopie électronique (Schultz et al., 1989). Le domaine τA est composé des sous-unités τ131, τ95 et τ55 tandis que le domaine τB est composé des sous-unités τ138, τ91 et τ60.
L’association spécifique et stable de TFIIIC au promoteur intragénique de type 2 exige d’abord l’établissement d’une liaison forte entre τB et la boîte promotrice B, puis une liaison faible de τA à la boîte promotrice A (Marzouki et al., 1986 ; Deprez et al., 1999 ; Ducrot et al., 2006 ). L’association des domaines de TFIIIC et le recrutement du facteur de transcription TFIIIB par TFIIIC sur le gène implique particulièrement la sous-unité τ60 de τB (Mylona et al., 2006).
Le facteur TFIIIB
Le facteur TFIIIB (200 kDa) est le facteur nécessaire au recrutement de l’ARN Pol III quel que soit le type de promoteur du gène. Le facteur TFIIIB n’est pas une entité moléculaire stable : son activité peut être séparée par chromatographie en deux fractions nommées B’ et B’’ (Kassavetis et al., 1990 ; Huet et al. 1994). Deux des sous-unités de TFIIIB, Brf1 et TBP, sont présentes dans la fraction B’ (Margottin et al., 1991; Kassavetis et al., 1992b; Lobo et al., 1992; Simmen et al., 1992) tandis que la troisième sous-unité, Bdp1, est présente dans la fraction B’’ (Bartholomew et al., 1991; Kassavetis et al., 1991).
Parmi les trois sous-unités de TFIIIB, la protéine TBP (TATA Binding Protein, 27 kDa) a la particularité d’être un facteur commun aux transcriptions par les trois types d’ARN Pol I, II et III (Margottin et al., 1991 ; Steffan et al., 1996). TBP se lie à l’ADN, au niveau de la boîte TATA située en amont du site d’initiation des gènes. Elle contribue à la stabilité de la liaison du facteur entier TFIIIB sur les gènes de classe III (Huet and Sentenac, 1992). On notera l’existence chez les mammifères de trois paralogues de TBP : les TBP-related factors (TRF). Parmi eux, TRF1 et TRF3 sont vraisemblablement les seules formes impliquées dans la transcription par l’ARN Pol III (pour revue, Teichmann et al., 2010).
Une deuxième sous-unité de TFIIIB est la protéine Brf1 (pour TFIIB related factor 1, 67 kDa). Cette sous-unité est importante dans la stabilité du complexe TFIIIB•ADN et dans le recrutement de l’ARN Pol III au promoteur. La région N-terminale de Brf1 interagit non seulement avec TBP (SCHRODER et al. 2003) mais aussi avec TFIIIC (CHAUSSIVERT et al. 1995 ; WANG and ROEDER 1995). D’ailleurs, cette partie N-terminale de Brf1 est homologue au facteur TFIIB (facteur de la transcription par l’ARN Pol II) qui interagit de manière très comparable avec le facteur TFIID qui contient TBP pour recruter l’ARN Pol II sur l’ADN (ORPHANIDES et al. 1996; revue de SCHRAMM and HERNANDEZ 2002). La partie C-terminale de la protéine Brf1 ne présente aucune similitude avec d’autres facteurs de transcription mais possède trois régions conservées dont notamment une impliquée dans des interactions avec les autres sous-unités TBP et Bdp1 (KASSAVETIS et al. 2006). Finalement, Brf1 participe aux dernières étapes de l’initiation, notamment lors de l’ouverture de la double hélice d’ADN et au démarrage de la fourche de transcription (KASSAVETIS et al. 2003). Chez les mammifères, deux formes du facteur TFIIIB coexistent suivant la présence de Brf1 (TFIIIB-β) ou de son isoforme Brf2 (TFIIIB-α) ; le facteur humain TFIIIB-β est requis pour les promoteurs de types 1 et 2 alors que le facteur TFIIIB-α est celui nécessaire au recrutement de l’ARN Pol III sur le gène humain de l’ARNsn U6 (promoteur de type 3) (Teichmann et Seifart., 1995 ; Teichmann et al., 1997 ; McCulloch et al., 2000).
La troisième sous-unité de TFIIIB est la protéine Bdp1 (pour TFIIIB double prime 1, 68 kDa). Bdp1 est nécessaire à l’assemblage de TFIIIB. Il interagit en effet in vitro avec le complexe TFIIIC•Brf1•TBP•ADN et le stabilise, rendant ainsi possible le recrutement de l’ARN Pol III (Rüth et al., 1996). L’analyse de la séquence polypeptidique de Bdp1 révèle un domaine caractéristique de liaison à l’ADN, le domaine SANT, qui interagit avec Brf1 (Aasland et al., 1996). Bdp1, conjointement avec Brf1, est particulièrement impliqué dans l’ouverture du promoteur et dans l’initiation de la transcription par l’ARN Pol III (Kassavetis et al., 2003). Bdp1 joue également un tout autre rôle, dans la maturation des ARNt, via une interaction avec la RNase P (Ishiguro et al., 2002).
Les différentes étapes de la transcription par l’ARN Pol III chez Saccharomyces cerevisiae
La caractérisation des facteurs de transcription est loin d’être précise. Néanmoins un modèle séquentiel a été proposé sur la base des interactions découvertes et des nombreuses expériences de transcription in vitro.
La transcription d’un gène peut être décomposée en quatre étapes distinctes (pour une revue, Paule et White, 2000) (figure 6). La première est le recrutement des facteurs généraux de transcription au niveau des promoteurs puis la reconnaissance par l’ARN Pol III de ce complexe ADN•facteur. La Pol III est alors présente au site d’initiation de la transcription, en interaction directe avec l’ADN et les facteurs. Cet ensemble forme le complexe de pré-initiation (PIC). Ensuite, à la deuxième étape qui est l’initiation, une bulle de transcription se forme, correspondant à la dénaturation locale de l’ADN et à l’ouverture du double-brin. Puis à la troisième étape, la Pol III entre en élongation processive et incorpore les nucléotides à l’ARN naissant. Enfin, à l’arrivée au terminateur, l’ARN transcrit est libéré, et l’ARN Pol III peut être recyclée de manière facilitée sur le même gène.
La formation du complexe de pré-initiation
La formation du complexe de pré-initiation est la première étape, cruciale, de la transcription par l’ARN Pol III. C’est à cette étape que l’ARN Pol III est correctement positionnée sur le site d’initiation de la transcription. Cette étape conduit à l’assemblage de l’ensemble des facteurs essentiels à l’initiation de la transcription (figure 7).
Dans le cas du gène RDN5 (spécifiant l’ARNr 5S), la formation du complexe de préinitiation débute par la liaison de TFIIIA sur les séquences promotrices. Les doigts de zinc de la région N-terminale de TFIIIA se lient à la boîte promotrice C au niveau du grand sillon de la double hélice d’ADN. Cette liaison constitue le principal point d’ancrage de TFIIIA au promoteur du gène. Une liaison de plus faible affinité s’établit ensuite entre d’autres doigts de zinc et la boîte promotrice A (Nolte et al., 1998). La liaison de TFIIIA aux séquences promotrices du gène de l’ARNr 5S est hautement spécifique mais relativement instable (Hanas et al., 1984). Elle est cependant stabilisée par l’association de TFIIIC (Keller et al., 1992).
Pour l’ensemble des autres gènes de classe III, le premier facteur recruté sur les séquences promotrices est TFIIIC chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Les sous-unités τ138 et τ91 du sous-domaine τB coopèrent pour la liaison de TFIIIC à l’ADN (Arrebola et al., 1998). Les protéines τ95 et τ55 du sous-domaine τA se positionnent ensuite respectivement près de et à l’extrémité 3’ de la boîte A. La sous-unité τ55 est en contact direct avec τ95 par son extrémité C-terminale (Manaud et al., 1998), tandis que τ60 semble faire le pont entre les domaines τA et τB (Deprez et al., 1999). Ensuite, τ60 et τ131 conduisent le recrutement de TFIIIB en interagissant notamment avec les sous-unités Bdp1 et TBP de TFIIIB (Rüth et al., 1996; Dumay-Odelot et al., 2002 ; Mylona et al., 2006). τ131 est une protéine très structurée, formée d’une succession d’hélices α, dont les changements de conformation induits par mutation peuvent altérer le recrutement de Brf1 (Moir and Willis, 2004). Le réseau d’interactions entre les deux facteurs généraux de transcription TFIIIC et TFIIIB conduit ainsi au positionnement de TFIIIB sur les régions en amont du site d’initiation de la transcription.
Une fois le facteur TFIIIB recruté par TFIIIC, le complexe TFIIIB•ADN est stable. Cette stabilité ne dépend plus de la présence de TFIIIC sur l’ADN : in vitro, TFIIIC peut être dissocié de l’ADN par compétition avec de l’héparine, tandis que TFIIIB reste lié à l’ADN (Kassavetis et al., 1990).
La mise en place de la machinerie transcriptionnelle est terminée par le recrutement et le positionnement correct de l’ARN Pol III. Elle implique essentiellement TFIIIB. Le positionnement de la Pol III au site initiateur de la transcription est assuré par un certain nombre d’interactions protéiques entre les sous-unités de TFIIIB, de TFIIIC et celles de la Pol III. Les sous-unités C82, C34 et C31 de l’ARN Pol III sont requises dans la reconnaissance du complexe TFIIIB•ADN (Werner et al., 1992; Thuillier et al., 1995). Ensuite, du côté de TFIIIB, sa sous-unité Brf1 interagit avec les sous-unité C34 et C17 de l’ARN Pol III (Werner et al., 1993; Khoo et al., 1994; Andrau et al., 1999 ; Ferri et al., 2000). Du côté de TFIIIC, la sous-unité τ131 interagit avec les sous-unités C53 et ABC10α de l’ARN Pol III tandis que la sous-unité τ138 est en relation avec ABC10α (Lefebvre et al., 1994 ; Dumay et al., 1999; Flores et al., 1999).
Holoenzyme ou assemblage séquentiel de la machinerie de transcription ?
La formation du complexe d’initiation de la transcription par l’ARN Pol III a tout d’abord été décrite comme un mécanisme séquentiel, grâce à des expériences in vitro. Le modèle d’assemblage séquentiel propose que les facteurs généraux de transcription se fixent sur le promoteur dans un ordre précis et assurent le recrutement ultérieur de l’ARN Pol.
Toutefois, à ce modèle séquentiel s’oppose le modèle de type holoenzyme dans lequel la machinerie de transcription est pré-assemblée et fonctionnelle. L’existence de sous-complexes pré-assemblés de la machinerie de transcription par l’ARN Pol III a été observée (Wang et al., 1997; Lane et al., 2011). Chez S. cerevisiae, un holoenzyme fonctionnel a pu être caractérisé mais dans une proportion très faible (moins de 1% des ARN Pol III) (Chédin et al., 1998b). Cet holoenzyme pourrait par conséquent provenir d’un complexe de pré-initiation assemblé séquentiellement qui aurait été co-purifié dans des conditions ménagées. Une autre hypothèse expliquant la présence de sous-complexes pré-assemblés est que les sous-unités se séquestrent en s’associant. Cette séquestration empêcherait ainsi des interactions avec d’autres protéines compétitrices et favoriserait par ailleurs l’interaction des sous-unités de la machinerie de transcription entre elles (Geiduscheck et Kassavetis, 2001).
La régulation de la transcription par l’ARN Pol III
Au cœur de la cellule, de nombreux mécanismes se coordonnent et sont finement régulés en réponse à des changements environnementaux qui peuvent constituer un stress ponctuel ou permanent pour la cellule. L’adaptation de son métabolisme constitue un enjeu majeur pour la survie de la cellule. Cette adaptation en fonction des conditions environnementales nécessite entre autres la régulation de la transcription par l’ARN Pol III, essentielle à la synthèse des protéines et à la croissance.
Dans cette dernière partie de l’introduction, nous décrirons quelques modulateurs ainsi que les régulations connues auxquelles la transcription par l’ARN Pol III est soumise.
Modulateurs de la transcription par l’ARN Pol III
Contrairement au système de transcription par l’ARN Pol II, seul un petit nombre d’éléments modulateurs a été identifié au cours d’études sur la transcription par l’ARN Pol III. Certains d’entre eux ont été identifiés chez les animaux et ne semblent pas conservés chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Parmi les facteurs stimulant la transcription par l’ARN Pol III, on répertorie TFIIA, TFIIS, Nhp6, Staf, la protéine La, les facteurs NF1, la topoisomérase I,PC4, l’activité TFIIIE et la RNAse P. Du côté de la répression, on recense la protéine Dr1. Tous ces facteurs, récapitulés en tableau 1 , ont été plus ou moins bien caractérisés et peuvent réguler la transcription à plusieurs étapes, de l’initiation à la réinitiation.
TFIIA et TFIIS
Deux facteurs de la machinerie de transcription par l’ARN Pol II, TFIIA et TFIIS, respectivement impliqués dans l’initiation et l’élongation de la transcription par l’ARN Pol II (pour revue récente, Nechaev et Adelman, 2010), sont capables de stimuler la transcription par l’ARN Pol III. La fonction réelle de ces facteurs dans la transcription par l’ARN Pol III reste largement incomprise.
L’addition de TFIIA recombinant à un système de transcription reconstitué avec des fractions hautement purifiées de TFIIIB, TFIIIC et d’ARN Pol III stimule la transcription des trois types de gènes transcrits par l’ARN Pol III (gènes d’ARNt, viraux, de l’ARNr 5S et de l’ARNsn U6) (Waldschmidt et Seifart, 1992 ; Meissner et al., 1993). Par ailleurs, des analyses d’immunoprécipitations de chromatine (ChIP) avec le facteur TFIIA n’ont pas permis de montrer que ce facteur était présent sur les gènes transcrits par l’ARN Pol III, minorant l’idée d’une implication directe de TFIIA dans la transcription par l’ARN Pol III in vivo (Fairley et al., 2005).
Contrairement à TFIIA, le facteur TFIIS est présent sur les gènes transcrits par la Pol III, et des mutations dans ce facteur affectent l’occupation de l’ARN Pol III sur ces gènes (Ghavi-Helm et al., 2008). L’une de ces mutations conduit, dans des conditions de croissance particulières, à une diminution partielle de la transcription des gènes de classe III. En complément, des transcriptions réalisées in vitro montrent que le facteur de transcription TFIIS aide à la sélection correcte du site d’initiation de la transcription par l’ARN Pol III (Ghavi-Helm et al., 2008). Son rôle dans la transcription in vivo par l’ARN Pol III n’est pas encore précisé.
Nhp6
Un autre stimulateur de la transcription par l’ARN Pol III est également important à l’étape d’initiation : il s’agit de la protéine Nhp6. Cette protéine fait partie de la famille des protéines chromatiniennes HMG (high mobility group), qui se lient de manière non spécifique à l’ADN.
Un premier lien entre Nhp6 et la transcription par l’ARN Pol III a été mis en évidence lors d’un crible génétique visant à supprimer la mutation des gènes NHP6 (A et B) : le gène codant pour Brf1 (sous-unité de TFIIIB), le gène SNR6 codant pour l’ARNsn U6 (transcrit par la Pol III) et celui codant pour une forme mutée de la sous-unité τ131 de TFIIIC sont des suppresseurs de la létalité causée par la mutation de Nhp6 (Kruppa et al., 2001). Et à l’inverse, les gènes NHP6 ont été retrouvés en tant que suppresseurs d’une mutation de SNR6 (Lopez et al., 2001). Nhp6 est requis pour la transcription efficace de l’ARNsn U6 in vivo (Martin et al., 2001) et est également capable de stimuler la transcription du gène in vitro reconstituée à partir d’extraits cellulaires bruts dépourvus de Nhp6 ou de fractions purifiées de Pol III et des facteurs de transcription (Kruppa et al., 2001 ; Lopez et al., 2001 ; Braglia et al., 2007).
Nhp6 est important au niveau du promoteur du gène, par sa capacité de structuration de la chromatine (Lopez et al., 2001). Sur le gène SNR6, l’occupation de la sous-unité TBP est réduite en l’absence de Nhp6 dans la cellule (Eriksson et al., 2004). Nhp6 est également impliqué dans l’initiation de la transcription d’autres gènes transcrits par la Pol III : dans un système de transcription reconstitué in vitro à partir de protéines hautement purifiées, la présence de Nhp6 est requise pour démarrer la transcription du gène d’ARNtTyr SUP4 au bon site d’initiation. Des analyses d’empreintes à la DNase I suggèrent qu’en absence de Nhp6, la liaison de TFIIIB sur l’ADN est réduite, son positionnement est alors moins précis et entraînerait des initiations à plusieurs sites d’initiation distincts (Kassavetis et Steiner, 2006). Par la suite, l’analyse des ARNt non maturés dans une souche de levure dépourvue de Nhp6 a confirmé sa fonction dans la reconnaissance du site d’initiation de la transcription in vivo de certains ARNt. Chez la levure, l’action de Nhp6 sur la transcription des ARNt semble dépendante des séquences en amont du promoteur des gènes : la fixation de TFIIIB au promoteur serait facilitée, par un remodelage local de la chromatine au niveau des séquences promotrices (Giuliodori et al., 2003 ; Braglia et al., 2007).
Enfin, très récemment, une analyse globale de l’occupation du génome de Saccharomyces cerevisiae montre que Nhp6 est présent au niveau des gènes d’ARNt (Venters et al., 2011).
Staf
Ensuite, toujours parmi les stimulateurs de la transcription par l’ARN Pol III, on trouve la protéine Staf (pour selenocysteine tRNA gene transcription activating factor). Cette protéine a été découverte dans le modèle batracien Xenopus laevis, en tant que stimulateur de la transcription in vivo du gène de l’ARNtSec (Schuster et al. 1995). Staf possède un orthologue humain : ZNF143 (Myslinski et al., 1998). Leur rôle dans la stimulation de la transcription d’ARNsn (transcrits par la Pol III) et d’un certain nombre d’ARN transcrits par la Pol II a été mis en évidence (Schaub et al., 1997).
L’activité stimulatrice de la transcription par l’ARN Pol III implique de manière déterminante l’un des sept doigts de zinc de la protéine dans la reconnaissance des séquences SBS (Staf Binding Sites) au sein des promoteurs (Schaub et al., 1999a et b). Staf/ZNF143 a également été étudié sous le nom de SBF, pour SPH-binding factor, où SPH (SphI postoctamer homology) est un autre motif retrouvé dans les promoteurs de type 3 des gènes transcrits par l’ARN Pol III (Kunkel et al., 1996 ; Rincon et al., 1998). Une étude de l’effet de Staf/ZNF143/SBF sur la stimulation de la transcription de l’ARN U6 montre que la protéine s’associe in vivo à CHD8, une protéine chromatinienne de la famille des CHD (chromodomain-helicase-DNA binding) (Yuan et al. 2007). Cette association est requise non seulement pour une transcription efficace de l’ARN U6 transcrit par l’ARN Pol III mais également pour la transcription par l’ARN Pol II d’un gène, IRF3 (dont la stimulation de la transcription par Staf/ZNF143 est connue). Cette donnée montre l’intérêt des structures et du remodelage chromatiniens au cours de la transcription par l’ARN Pol III.
La protéine La, NF1, Topo I et PC4
A la différence des protéines TFIIS, Staf et Nhp6, qui interviennent au niveau de l’initiation de la transcription par l’ARN Pol III, d’autres protéines sont capables de stimuler cette même transcription via l’étape de terminaison et de réinitiation. C’est le cas de la protéine La, des facteurs NF1, de la topoisomérase I et de la protéine PC4.
Initialement, la protéine La (également appelée Lhp1) a été découverte en tant que protéine qui se fixe à la queue des petits ARN néosynthétisés (Rinke et Steitz, 1982 ; Curry et Conte, 2006). Cette protéine ubiquitaire aide à la biogenèse de ces petits ARN, en les protégeant des exonucléases et en facilitant leur assemblage dans des complexes ribonucléoprotéiques, telle une chaperonne (Pannone et al., 1998 ; Maraia et Intine, 2002). La protéine La est également impliquée dans la rétention au noyau de certains de ces ARN et serait impliquée dans la régulation de la traduction de certains messagers (pour revue, Wolin et Cedervall, 2002).
Des analyses de transcription in vitro réalisées avec des extraits de cellules humaines HeLa montrent que la protéine La influence l’efficacité de la transcription par l’ARN Pol III : son immunodéplétion conduit à une chute importante de la transcription par l’ARN Pol III, et cette transcription est restaurée lorsque la protéine La est réintroduite (Gottlieb et Steitz, 1989). La stimulation de la transcription par l’ARN Pol III par la protéine La humaine réside d’une part en sa participation à la terminaison de la transcription et à la stabilisation des transcrits dans un système in vitro (avec des complexes de transcription pré-assemblés in vitro) (Maraia et al., 1994). D’autre part, elle réside également dans son implication dans l’initiation in vitro des gènes humains VA1, 7SL et B1 ainsi qu’en sa capacité à stimuler la réinitiation facilitée de la transcription (Maraia, 1996). Ces effets transcriptionnels sont régis par un domaine distinct à celui de la liaison aux ARN néosynthétisés (Goodier et al., 1997). De plus, l’activité stimulatrice de la protéine La humaine requiert la simple déphosphorylation de sa sérine 366, médiée par la caséine kinase II (CK2) (Fan et al, 1997).
Cependant aucune phosphorylation ne semble intervenir dans le cas de la levure Saccharomyces cerevisiae (Long et al., 2001). Des expériences de ChIP ont pu par ailleurs mettre en évidence la présence de la protéine La sur les gènes transcrits par l’ARN Pol III (Fairley et al., 2005).
Le rôle de la protéine La semble complexe car d’autres études contredisent certaines des observations précédentes qui la décrivent comme un activateur de la transcription par l’ARN Pol III. D’une part, un système de transcription reconstitué in vitro à partir de fractions (de cellules humaines HEK) dans lesquelles la protéine La a été immunodéplétée est fonctionnel ; d’autre part, l’addition de protéine recombinante La n’a aucune influence sur l’efficacité de la transcription (Weser et al., 2000). En outre, chez la levure S. cerevisiae et le batracien X. laevis, la protéine La n’est pas requise pour la transcription par l’ARN Pol III (Yoo et Wolin, 1997 ; Lin-Marq et Clarkson, 1998). Toutefois, l’absence de la protéine La chez S. cerevisiae conduit tout de même à l’observation d’un plus grand nombre de Pol sur les gènes codant pour l’ARNr 5S, bien que ni la quantité, ni la qualité de l’ARNr n’en soit affectée (French et al., 2008). La protéine La pourrait participer au relargage efficace de l’ARN Pol III. Les conditions dans lesquelles la protéine La stimule la transcription de gènes par l’ARN Pol III reste donc encore à être clarifiée.
Ensuite, la famille des protéines NF1 (Nuclear Factor 1, également connus sous le nom de CTF pour CAAT box transcription factor) représente également un stimulateur de la transcription par l’ARN Pol III. Cette famille de protéines est présente uniquement chez les eucaryotes supérieurs, notamment chez les vertébrés, et intervient dans la réplication d’ADN viral et dans la régulation (notamment en tant qu’activateurs) de nombreux gènes (pour revue, Gronostajski, 2000 ; Pjanic et al., 2011).
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Table des matières
Abréviations
Chapitre 1 : Introduction
1.1 Introduction générale
1.1.1 Le flux de l’information génétique
1.1.2 Quelques mots sur notre modèle d’étude, la levure Saccharomyces cerevisiae
1.2 La transcription par l’ARN Pol III chez Saccharomyces cerevisiae
1.2.1 Les transcrits par l’ARN Pol III
1.2.2 Les composants de la machinerie de transcription par l’ARN Pol III
1.2.3 Les différentes étapes de la transcription par l’ARN Pol III chez Saccharomyces cerevisiae
1.3 La régulation de la transcription par l’ARN Pol III
1.3.1 Modulateurs de la transcription par l’ARN Pol III
1.3.2 La transcription par l’ARN Pol III est régulée in vivo en fonction d’autres mécanismes cellulaires
1.4 La répression de la transcription par l’ARN Pol III converge vers Maf1
1.4.1 Maf1 intègre les signaux de diverses voies de signalisation
1.4.2 Maf1 est régulé par des phosphorylations et des déphosphorylations
1.4.3 Interactions de Maf1 avec la machinerie de transcription par l’ARN Pol III
1.5 Problématique
Chapitre 2 : Etude d’un régulateur de la transcription par l’ARN Pol III : la protéine Sub1
2.1 La transcription par l’ARN Pol III in vivo est plus complexe que celle reconstituée in vitro
2.2 La protéine Sub1 et son orthologue PC4
2.2.1 Les fonctions de Sub1/PC4
2.3 Sub1 est un régulateur de la transcription par l’ARN pol III
2.4 Résultats et discussions
2.4.1 Localisation de Sub1 sur le génome
2.4.2 Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l’initiation et la réinitiation facilitée
2.4.3 Sub1 est requis pour une transcription par l’ARN Pol III optimale
2.4.4 Sub1 est-il impliqué dans la transcription par l’ARN Pol I ?
Chapitre 3 : Interactions de Sub1 et régulation de la transcription par l’ARN Pol III
3.1 Introduction
3.2 Etude des fonctions respectives de Sub1 et Maf1 dans la transcription par l’ARN Pol III
3.2.1 Croissance des souches sub1, maf1 et sub1 maf1
3.2.2 Comparaison des niveaux de transcrits Pol III dans les souches délétées pour SUB1 et/ou MAF1, en 4NQO ou en rapamycine
3.2.3 Immunodétection des protéines Sub1 et Maf1 dans des cellules traitées au 4NQO ou à la rapamycine
3.2.4 Localisation cellulaire des protéines Sub1 et Maf1
3.2.5 Conclusion de l’étude de la fonction de Sub1 par rapport à Maf1
3.3 Construction de double délétants et tests de croissance
3.3.1 Souches construites
3.3.2 Tests de croissance
3.4 Perspectives à l’étude des double délétants obtenus
Chapitre 4 : Discussion et perspectives
4.1 La protéine Sub1, un facteur de transcription complexe
4.1.1 Sub1 et la transcription par l’ARN Pol III
4.1.2 Sub1 pourrait-il être impliqué la transcription par l’ARN Pol I ?
4.1.3 Quels sont les domaines fonctionnels de Sub1 ?
4.2 D’autres conditions de croissance où Sub1 pourrait être essentiel ?
4.3 Considérations sur l’analyse de la transcription par l’ARN Pol III
4.3.1 Les gènes de classe III sont-ils tous transcrits de manière équivalente ?
4.3.2 Synthèse, maturation, export, dégradation
4.4 D’autres régulateurs de la transcription par l’ARN Pol III ?
4.4.1 La répression de la transcription par l’ARN Pol III en réponse au 4NQO
4.4.2 Quels autres mécanismes de régulation de la transcription par l’ARN Pol III peuvent exister ?
Chapitre 5: Procédures expérimentales
5.1 Méthodes de biologie cellulaire
5.1.1 Souches de levures Saccharomyces cerevisiae et conditions de culture
5.1.2 Transformation de levure
5.1.3 Tests de croissance sur milieu solide
5.1.4 Méthodes d’imagerie
5.1.5 Acquisition d’images
5.2 Méthodes de biologie moléculaire
5.2.1 Délétion de SUB1 dans les souches de la banque EUROFAN II
5.2.2 Extraction d’ADNg
5.2.3 Extraction protéique à l’acide trichloroacétique (TCA)
5.2.4 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunodétection de protéines7 (western-blot)
5.2.5 Extraction des ARN
5.2.6 Détection d’ARN (northern-blot)
Annexes
Bibliographie
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