Influence de la température sur la dynamique des protéines LH1 et LH2

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LH2 : antennes périphériques

Une avancée importante dans la compréhension de l’organisation moléculaire des protéines antennes a été la détermination de la structure 3D à haute résolution des protéines LH2 par rayons X à partir de 1995 (Koepke et al., 1996; McDermott et al., 1995; McLuskey et al., 2001). L’analyse de la structure du LH2 de Rps. acidophila 10050 a révélé que ce complexe forme un anneau de 9 hétérodiméres αβ, liant de manière non covalente des molécules de bactériochlorophylles (Bchls) et de caroténoïdes. Les polypeptides α forment un anneau externe de 68Å de diamètre tandis que les polypeptides β s’organisent en une forme annulaire interne de 36Å de diamètre (Fig. 1-19)
Chaque dimère αβ lient 3 molécules de Bchl a et 1 molécule de caroténoïde, par conséquent l’anneau de LH2 comporte 27 Bchl a et 9 caroténoïdes. L’arrangement des Bchl a au sein du LH2 peut être divisé en deux groupes distincts :
– à l’extrémité N-terminale du complexe LH2, les polypeptides α et β lient une molécule de Bchl a, dont le cycle bacteriochlorine (cf iii-1, structure des Bchl a, Fig. 1-21) est parallèle au plan de la membrane. Puisque chaque hétérodimére αβ lie une Bchl a dans cette configuration, 9 Bchl a sont en interaction avec des distances Mg2+ – Mg2+ d’environ 21Å et forment un anneau qui donnent naissance à une bande d’absorption à 800 nm, et que l’on appelle B800.
– Dans la région transmembranaire de l’hétérodimére αβ se trouve un dimère de Bchls, dont les cycles bactériochlorines sont perpendiculaires au plan de la membrane. Les 18 Bchls en interaction forment un agrégat circulaire symétrique (en forme d’anneau) dont le maximum d’absorption est à 850 nm, et que l’on appelle B850. La structure du LH2 obtenue par McDermott et al. en 1995 a également mis en évidence la présence d’une molécule de caroténoïde par hétérodimére αβ. Ce caroténoïde, rhodopine glucoside, présente une conformation cis-trans et traverse la totalité de la protéine. Il interagit principalement avec les résidus polaires à l’extrémité N-terminale du polypeptide α, et joue un rôle très important dans la stabilité du complexe LH2.

RC-LH1 : antennes cœur et centre réactionnel

Des études par cristallographie électronique et cryo-EM ont permis d’obtenir pour la première fois une structure à 8,5Å de résolution d’un cristal 2D de RC-LH1 purifié à partir de la bactérie R. rubrum (Karrasch et al., 1995). Ces images ont montré que la protéine LH1 présente une structure circulaire composée de 16 hétérodiméres αβ, et proposant en son centre un trou capable de contenir le centre réactionnel. Depuis ce résultat, des études par AFM et cryo-EM ont permis de révéler un nombre important de structures de RC-LH1, adoptant des conformations très variables à l’instar de la protéine LH2, toujours parfaitement circulaire. Le RC-LH1 peut être circulaire (Gerken et al., 2003), sous forme de S (Scheuring et al., 2005a; Scheuring et al., 2004; Siebert et al., 2004), elliptique (Fotiadis et al., 2004; Scheuring et al., 2003) ou bien encore en arc (Bahatyrova et al., 2004). Il semble toutefois qu’il n’existe que deux classes distinctes caractérisant le complexe RC-LH1 in vivo : sous forme monomérique comme c’est le cas chez Rps. palustris et Rsp. rubrum (le centre réactionnel est entouré d’un seul LH1) ou dimérique comme par exemple chez Rb. sphaeroides (Fig. 1-16). Une des particularités du complexe RC-LH1 est d’être beaucoup moins stable que la protéine LH2 en présence de détergent, c’est pourquoi il n’existe qu’une seule structure cristallographique de ce complexe (Roszak et al., 2003) et qu’aucune structure à haute résolution de la protéine LH1 seule n’a été obtenue à ce jour. La structure du RC-LH1 de Rps. palustris a été obtenue à 4,8Å par le groupe de R. Cogdell en 2003, mais à cette résolution il est impossible de distinguer les détails moléculaires et notamment les interactions pigments-protéines essentielles pour la compréhension de la fonction de ce complexe. Le modèle moléculaire établi par Cogdell et coll. est présenté sur la Figure 1-20, montrant notamment l’arrangement des hélices transmembranaires du LH1 en un anneau elliptique de 110Å de diamètre externe, entourant le centre réactionnel dont la taille maximum est de 78Å.

Pigments photosynthétiques

Les antennes photosynthétiques des bactéries pourpres ont pour fonction d’absorber efficacement la lumière, de transférer l’énergie d’excitation aux centres réactionnels avec un rendement maximal, et de dégrader l’excès d’énergie sans dommage pour l’appareil photosynthétique. Deux classes distinctes de pigments sont capables d’assurer conjointement ces fonctions : les bactériochlorophylles et les caroténoïdes.

Bactériochlorophylle a (Bchla)

Les chlorophylles sont des pigments très abondants sur terre, très répandus chez les eubactéries et ubiquitaires chez les plantes. Les bactériochlorophylles sont des dérivés chimiques des chlorophylles, ces dernières étant classées dans la famille des tétrapyrroles (au même titre que les hèmes et autres porphyrines). Ces molécules présentent une structure de faible symétrie et sont constituées d’un macrocycle bactériochlorine contenant quatre cycles pyrroliques (I à IV) couplés à un atome central de magnésium et un isocycle (V) fusionné sur ce macrocycle (Fig. 1-21)

Fonction des protéines collectrices de lumière (protéines antennes)

Relation structure/fonction des protéines antennes LH1 et LH2

L’observation du spectre d’absorption des protéines antennes LH1 et LH2 permet d’obtenir des informations sur leur structure et leur fonction. Les pigments présents dans ces complexes sont localisés dans des environnements chimiques différents, capables de modifier les caractéristiques spectrales des protéines antennes. Les protéines LH1 et LH2 ont été définies par la position en nanomètres de la transition Qy des Bchls qu’elles lient (Cogdell et al., 1985). En effet, cette transition de plus basse énergie est plus sensible aux états d’interaction des Bchls au sein des complexes, et peut ainsi subir un déplacement vers le proche-infrarouge de plus de 100 nm. Au contraire, les positions de la transition Qx (à 595 nm) et des bandes de Soret (vers 370 nm) ne sont pas ou peu influencées par leur environnement local. A partir de ces informations, une nomenclature a été proposée, à savoir que les LH2 sont appelées B800-B850 en référence à la transition Qy des 9 Bchls absorbant à 800 nm et des 18 Bchls absorbant à 850 nm, et que les LH1 sont appelés B875 en référence à la transition Qy des 32 Bchls absorbant à 875 nm.
Le déplacement de la transition Qy des Bchls est la résultante des interactions entre les polypeptides et les Bchls mais également des pigments entre eux.

Les interactions Bchl/polypeptide

L’influence du site protéique de liaison des Bchls sur la position de l’absorption de celles-ci a été déterminée par des expériences en spectroscopie électronique et Raman de résonance, sur des protéines LH1 et LH2 modifiées par mutagenèse dirigée. Il a été possible de mettre en évidence le rôle important de résidus tryptophane et tyrosine impliqués dans les liaisons avec les groupements carbonyle acétyle des Bchls des LH1 (Olsen et al., 1994; Sturgis et al., 1997) et des LH2 (Fowler et al., 1994; Fowler et al., 1992). Ces modifications entraînent la rupture d’une ou de deux liaisons hydrogène et induisent respectivement un déplacement de la transition Qy vers le bleu d’environ 10 et 20 nm. Des études semblables ont été réalisées afin de déterminer le rôle des interactions entre le magnésium central des Bchls et les polypeptides (Olsen et al., 1997), et également entre les carbonyles cétoniques et les résidus impliqués (Braun et al., 2003; Law et al., 2004; Sturgis et al., 1995). Ces expériences ont montré que ces liaisons ont très peu d’impact sur l’absorption et l’assemblage des protéines antennes. Cependant, la coordination du magnésium central avec les histidines entraîne une distorsion du macrocycle bacteriochlorine que l’on retrouve aussi bien chez les LH1 que chez les LH2 (Lapouge et al., 1999; Papiz et al., 2003). Cette distorsion ne semble pas avoir un effet très sensible sur les propriétés d’absorption (faible déplacement) (Gudowska-Nowak et al., 1990) mais plutôt sur le temps de vie de l’état excité des Bchls (Gentemann et al., 1997).

Rôle des interactions Bchl/Bchl

Les bactériochlorophylles à l’origine de la bande d’absorption à 850 nm (LH2) et 875 nm (LH1) sont en contact de van der Waals les unes avec les autres et forment un agrégat de forme circulaire. Les interactions excitoniques entre ces molécules seraient à l’origine du déplacement de la transition électronique Qy vers le proche-infrarouge (Van Grondelle et al., 1994). Des études ont montré qu’il est possible d’observer un déplacement vers le rouge de la transition Qy des LH1 sous haute pression hydrostatique, mais que ces phénomènes ne sont pas liés à une distorsion des Bchls ni à une perturbation des liaisons hydrogène impliquant les groupes carbonyles de ces molécules. Ces effets observés ont été attribués à une modulation des interactions pigment-pigment induite par la pression exercée (Sturgis et al., 1998). On sait que ces interactions sont sensibles à certains facteurs tels que la taille de l’agrégat, la distance entre les pigments (Fig. 1-24), les angles entre les dipôles et le désordre statique et dynamique (cf paragraphe 3 ci-dessous).

Absorption des protéines antennes

Pour tenter d’expliquer l’élargissement de la bande d’absorption de la transition Qy, il est essentiel de tenir compte de la force des interactions Bchl-Bchl. Si on considère qu’il y a peu d’interactions entre Bchls ou que ces interactions sont faibles, la transition Qy pourrait être apparentée à la somme des transitions électroniques de toutes les Bchls de l’anneau (les états excités pourraient être localisés sur une ou quelques molécules). Dans le cas contraire, en présence de fortes interactions, la transition Qy pourrait être représentée par une seule et unique transition électronique provenant de l’ensemble des Bchls qui se comporterait comme un multimére figé et ordonné (où l’excitation serait délocalisée de façon cohérente sur l’ensemble des Bchls). Cependant, les propriétés électroniques de la Qy dépendent également des variations des propriétés individuelles de chaque Bchl de l’anneau induites par le désordre, ce qui pourrait expliquer l’élargissement inhomogène de sa bande d’absorption. En effet, dans ce type d’assemblage entre molécules identiques, les différences physico-chimiques peuvent provenir de différences de conformation des molécules et de différences structurales dans leur environnement proche. Ces différences peuvent être liées au désordre intrinsèque de la structure (désordre statique) et à ses fluctuations dynamiques (désordre dynamique).
En appliquant cette théorie, des modèles de type excitonique ont été obtenus par calcul pour prédire la position de la transition Qy du LH2 (van Grondelle and Novoderezhkin, 2001). Il est indispensable d’introduire dans ces calculs la notion de désordre, c’est-à-dire considérer qu’à un instant donné, toutes les Bchls n’ont pas les mêmes propriétés optiques. Sur ce principe, le désordre est suffisamment important chez les protéines antennes LH1 et LH2 pour empêcher la délocalisation de l’exciton sur l’ensemble des molécules de Bchls. L’analyse des résultats de différentes méthodes spectroscopiques a révélé que l’excitation dans un anneau de LH2 absorbant à 850 nm est cohérente sur quelques molécules de Bchls (de 2 à 4) (Kuhn and Sundstrom, 1997)

Transfert d’énergie au sein des protéines antennes

Le transfert d’énergie au sein du photosystème bactérien, entre les protéines antennes et le centre réactionnel, est basé sur le mécanisme de Förster (Förster, 1948). Lorsqu’une molécule de Bchl absorbe la lumière, le temps de vie de l’état singulet excité est de l’ordre de 1 ns. C’est pourquoi le transfert d’énergie jusqu’au centre réactionnel doit avoir lieu pendant ce laps de temps (Fig. 1-25). Dans le photosystème bactérien, qui se comporte comme un entonnoir, ce transfert d’énergie est orienté vers le CR par un gradient d’énergie créé par la position de la transition électronique Qy. Cette unidirectionnalité confère au photosystème son efficacité, avec un rendement supérieur à 95%. Le gradient d’énergie chemine donc entre les LH2 (B800, B850 et caroténoïdes) et le centre réactionnel (P860, dimère de Bchl) via les LH1 (B875 et caroténoïdes). Les caroténoïdes, capables d’absorber la lumière, et qui sont en contact de van der Waals avec les Bchls, peuvent transférer leur énergie aux Bchl avec une efficacité variable (entre 30 et 100% selon les antennes et les espèces bactériennes). Au sein des protéines LH2, l’énergie d’excitation migre entre B800 dans un temps de 0,5 ps (Sundstrom et al., 1999), puis entre B800 et B850 en 1 ps environ (Kennis et al., 1996). Le transfert d’énergie est ensuite très rapide entre les molécules B850 qui sont en interaction (entre 50 et 150 fs) et se trouve délocaliser sur une partie de l’anneau (cf i-3). Ceci permet en effet à l’énergie d’excitation d’être accessible aux anneaux voisins en contact direct (autres LH2 ou LH1) quelque soit la localisation des Bchls excitées sur l’anneau de LH2. Le passage de l’énergie d’excitation entre les B850 du LH2 et les B875 du LH1 s’effectue en 3-5 ps environ (Sundstrom et al., 1999), et cette énergie migre très rapidement au sein du LH1, entre les B875 en interaction (environ 80 fs, (Visser et al., 1995)). Le transfert d’énergie se termine ensuite entre les B875 et le dimère de Bchls du centre réactionnel dans un temps relativement plus lent (entre 30 et 50 ps) (Van Grondelle et al., 1994). Ceci est certainement dû à la distance importante entre ces pigments (environ 30Å).

Assemblage des protéines antennes

La détermination des mécanismes moléculaires impliqués dans le processus d’assemblage des protéines antennes dans les membranes photosynthétiques a fait l’objet de très nombreuses études in vivo et in vitro. Il est possible par exemple d’induire des modifications de la séquence primaire des protéines antennes en utilisant les techniques de mutagenèse dirigée et d’observer l’influence de ces mutations sur l’assemblage. L’avantage de cette approche est l’obtention d’informations sur la mise en place de ces complexes dans des conditions quasi-natives, et en particulier dans leurs membranes natives. Une alternative à ce cheminement est la reconstitution de protéines antennes à partir de leurs composants isolés (polypeptides et pigments) afin d’étudier le processus d’assemblage in vitro (Ghosh et al., 1988; Parkes-Loach et al., 1988). De nombreux résultats ont été obtenus au début des années 1990 et concernent tout particulièrement la protéine LH1. Ces études sont présentées dans la revue proposée par P. Loach (Loach and Parkes-Loach, 1995).

LH2

Des études in vivo dans Rb. sphaeroides ont montré que la réduction partielle des extrémités Nterminales entraîne la formation de LH2 dépourvues de Bchls B800 (Koolhaas et al., 1998), et que l’altération aux extrémités C-terminales conduit à la formation d’anneaux non fonctionnels (Braun et al., 2002). D’autre part, comme c’est le cas chez la protéine LH1, la présence des résidus histidine conservés sont indispensables pour la liaison aux Bchls, et donc indispensables à l’assemblage du LH2 (Olsen et al., 1997). Par contre, les molécules de caroténoïdes sont essentielles pour l’assemblage du LH2 in vivo (Lang and Hunter, 1994), et pas forcément nécessaires pour le LH1. L’équipe de P. Braun s’intéresse de son côté au rôle des résidus présents au niveau de la région centrale hydrophobe des hélices transmembranaires. Ces auteurs ont pu montrer que seulement quelques résidus (ex : α-S27) ont des positions nécessaires et suffisantes pour permettre l’assemblage de protéines LH2 intactes (Braun et al., 2002; Braun et al., 2003; Kwa et al., 2004)

LH1

Les études in vivo sur l’assemblage du LH1 ont été développées chez les bactéries Rb. capsulatus et Rb. sphaeroides, et ont permis de mettre en évidence le rôle des sites de liaison des Bchls et des extrémités N et C-terminales dans ce processus. On peut citer notamment l’importance des résidus histidine (Olsen et al., 1997) et des tryptophanes (α-W43 et β-W47 ; (Olsen et al., 1994; Sturgis et al., 1997)), responsables du réseau de liaisons hydrogène entre les polypeptides α et β et les Bchls a, et important pour l’assemblage in vivo des LH1. D’autres études ont mis en évidence le rôle des charges électrostatiques présentes sur les polypeptides aux interfaces membranaires (Drews, 1996), mais également la part importante des interactions hydrophobes dans le processus d’assemblage entre polypeptides α et β (Sturgis and Robert, 1994).
Les protéines LH1 ont une stabilité en présence de détergent beaucoup plus faible que les protéines LH2. C’est pourquoi de nombreuses études de reconstitution des protéines LH1 ont été menées à partir de 1988. En effet, la position de la transition Qy des Bchls a dans un anneau natif de LH1 à 873 nm (chez R. rubrum G9, mutant dépourvu de caroténoïdes) dépend fortement des interactions entre hétérodiméres αβ. Une fois purifiée, la protéine peut être dissociée réversiblement en présence de détergent βOG dans une espèce absorbant à 820 nm (B820) correspondant aux dimères αβ isolés. Une augmentation de la concentration en βOG entraîne la dissociation du complexe B820 en une nouvelle espèce absorbant à 777 nm (Ghosh et al., 1988; Parkes-Loach et al., 1988). Cette forme spectrale B777 correspond à un mélange de polypeptides α et β liant chacun une molécule de Bchl a. Lorsque l’on réduit la concentration de βOG, les espèces B777 peuvent se réassocier et former des espèces absorbant à 873 nm.
Des études par protéolyse ménagée ont permis de déterminer les éléments structuraux minimaux pour la formation de B820, en diminuant/modifiant la taille des extrémités C et N-terminales (Kehoe et al., 1998; Meadows et al., 1998). De plus, des études ont montré la contribution importante de la concentration de détergent βOG (Arluison et al., 2002b) dans le maintien des formes intermédiaires en solution, et ont également permis de mettre en évidence la présence d’homodiméres ββ et l’absence de dimères αα dans les échantillons de B820. Seuls les dimères αβ sont cependant capables de reformer des formes spectrales absorbant à 873 nm (Arluison et al., 2002a). La réversibilité de ce processus de dissociation/réassociation de la protéine LH1 a permis d’estimer les paramètres thermodynamiques associés à la formation de B820 et de révéler la présence d’états oligomériques intermédiaires de taille plus importante (Pandit et al., 2003; Pandit et al., 2001; Sturgis and Robert, 1994; Vegh and Robert, 2002). Enfin, deux études simultanées suggèrent que les régions N-terminales sont aussi très importantes dans l’assemblage des LH1 in vitro et dans le processus de dimérisation des polypeptides α et β (Arluison et al., 2004; ParkesLoach et al., 2004). La notion de « poche hydrophobe » a été proposée pour expliquer le rôle central d’un résidu Trp (α-W45 chez R. rubrum) présent à l’interface membranaire (en N-terminal) dans la formation d’un réseau d’interactions hydrophobes impliquant environ 5 résidus apolaires voisins (Arluison et al., 2004).
Bien que toutes ces études aient été capables de mettre en évidence des résidus et des régions polypeptidiques indispensables pour permettre l’assemblage des protéines antennes, il est actuellement difficile de comprendre réellement quels sont les détails moléculaires qui contrôlent ce processus in situ dans les membranes photosynthétiques.

Les protéines antennes des bactéries pourpres : un système modèle pour des études en environnement membranaire

Cette introduction a mis en lumière les moyens techniques actuels mis en œuvre pour l’étude de la relation structure/fonction des protéines membranaires mais également les difficultés rencontrées au cours de l’utilisation de ces moyens. De nombreuses informations ont été obtenues à ce jour sur des protéines membranaires extraites de la membrane, et le plus souvent isolées dans une solution contenant des détergents. Une très grande majorité des protéines membranaires est peu exprimée dans leur environnement naturel, c’est pourquoi très peu d’études ont été développées sur ces macromolécules directement insérées dans la bicouche lipidique.
Les protéines membranaires photosynthétiques de type LH2 et RC-LH1, présentées dans la seconde partie de cette introduction, ont été très largement étudiées depuis l’obtention de la structure 3D à haute résolution du centre réactionnel de Blastochloris viridis au milieu des années 80. Ces protéines sont des modèles de choix pour l’étude des interactions entre polypeptides transmembranaires et entre les protéines et lipides. De plus, leur manipulation est très avantageuse par rapport aux autres protéines membranaires puisque ces protéines sont, comme la bactériorhodopsine chez Halobacterium halobium, très largement surexprimées dans les membranes intracytoplasmiques des bactéries pourpres photosynthétiques.

Table des matières

Avant-propos
Chapitre 1 Introduction générale
1.1 Organisation des membranes biologiques et structure des protéines membranaires
1.1.1 Organisation des membranes biologiques
1.1.2 Structure des protéines membranaires
1.2 Description de l’appareil photosynthétique bactérien
1.2.1 Photosynthèse bactérienne
1.2.2 Structures et variétés des complexes impliqués dans la photosynthèse bactérienne.
1.2.3 Fonction des protéines collectrices de lumière (protéines antennes)
1.2.4 Biosynthèse et assemblage du photosystème bactérien
1.2.5 Les protéines antennes des bactéries pourpres : un système modèle pour des études en environnement membranaire
1.3 Objectif de l’étude
Chapitre 2 Influence de la température sur la dynamique des protéines LH1 et LH2
2.1 Présentation des trois souches de Rhodospirillum rubrum : S1, S1S et G9
2.2 Temperature dependence of LH1 spectrum reflects the protein natural flexibility: a study of LH1 in native intracytoplasmic membranes
2.3 Résumé de l’article
2.4 Effet de la température sur la structure des protéines antennes LH2
Chapitre 3 Dissociation des protéines LH1 de Rhodospirillum rubrum dans leurs membranes natives
3.1 Introduction
3.1.1 Enoncé de la problématique
3.1.2 Synthèse des études de dissociation en présence de détergent : la protéine LH1 de Rsp. rubrum G9
3.2 Dissociation/réassociation de la protéine LH1 en présence de détergent
3.2.1 Dissociation de la protéine LH1 dans les membranes intracytoplasmiques chez Rsp. rubrum G9: effet du détergent βOG
3.2.2 Dissociation de la protéine RC-LH1 purifiée (G9 et S1) en DDM : effet de la température
3.3 Influence de la température sur le processus de dissociation-réassociation des protéines LH1 de S1, G9 et S1S en membranes natives
3.3.1 Effet de la température sur l’oligomérisation des protéines LH1 : étude par spectroscopie d’absorption
3.3.2 Analyse du processus de dissociation-réassociation du LH1 de S1, G9 et S1S – 131
3.4 Conclusion : chemin de dissociation et réassociation de la protéine LH1 en membrane native
Chapitre 4 Conclusions et perspectives
Chapitre 5 Matériels et méthodes
5.1 Souches et cultures bactériennes
5.1.1 Rhodospirillum rubrum S1, S1S et G9+
5.1.2 Rhodobacter sphaeroides DD13-LH2
5.2 Microscopie électronique
5.3 Préparation des membranes
5.4 Extraction et purification des complexes LH1 et RC-LH1
5.5 Spectroscopie d’absorption Visible-IR en fonction de la température
5.6 Spectroscopie Raman de résonance
5.7 Dichroïsme circulaire
5.8 Caractérisation du mutant Rsp. rubrum S1S
5.8.1 Construction du mutant
5.8.2 Cinétique de croissance et morphologie des bactéries
5.8.3 Caractérisation spectroscopique des membranes intracytoplasmiques
Annexes
Bibliographie

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