Soutenance mémoire
Coxsackievirus B4
Taxonomie et Structure
Chaque année, le nombre d’infections à entérovirus chez l’Homme est estimé à près d’un milliard. (Palacios and Oberte, 2005). Dans la plupart des cas, les conséquences de telles infections sont limitées à des syndromes viraux non spécifiques ; fièvre, céphalées, myalgies. Cependant, les entérovirus sont également la cause de pathologies sévères, telles que des encéphalites et myocardite, ou encore la poliomyélite provoquée par le poliovirus (Delpeyroux et al., 2013). Dans la famille des Picornaviridae le genre Enterovirus comporte plusieurs espèces (Tableau 1). L’espèce Enterovirus B comprend notamment coxsackievirus B4 (CV B4) et 5 autres sérotypes de coxsackievirus B (CV-B) 1-6 (Nikonov et al., 2017). Les CV-B sont de petits virus (<30nm) non enveloppés à ARN simple brin de polarité positive. Leur capside de symétrie cubique dont la forme est icosaédrique, comporte 60 capsomères dont chacun est constitué des 4 protéines structurales du virus ; VP1, VP2, VP3 et VP4. En cristallographie à rayons X, seules les protéines VP1, VP2 et VP3 sont visibles à la surface de la capside, VP4 est à l’intérieur de la capside (Mucklebauer and Rossman, 1997). La capside virale possède 20 faces, et 12 sommets. Les sommets de la capside sont des structures tridimensionnelles formées d’assemblage de 5 protéines VP1. Chaque sommet est entouré d’une dépression appelée « canyon », constituée principalement des protéines VP2 et VP3, abritant une poche hydrophobe constituée de la protéine VP1, qui est l’un des principaux sites d’interaction de la capside avec ses récepteurs cellulaires spécifiques (Mucklebauer and Rossman, 1997). A l’intérieur de la capside se trouve la protéine VPg, liée à l’ARN génomique du virus. Le génome de CV-B4, qui mesure près de 7400 bases, présente 2 régions non traduites (UTR) aux extrémités 5’ et 3’, une queue poly-A en 3’, mais est dénué de coiffe en 5’. Ces séquences hautement conservées contribuent à la stabilité du génome viral (Romero et al., 1997). Entre ces deux UTR se trouve un cadre ouvert de lecture (ORF) unique, codant pour les différentes protéines virales. L’ARN de CV-B4 est divisé en 3 régions P1, P2 et P3. La région P1 code pour les protéines structurales du virus (VP1, VP2, VP3 et VP4) tandis que les régions P2 et P3 codent pour les protéines non structurales du virus qui exercent leur fonction lors du cycle de réplication du virus (Figure 1). Lors de l’infection d’une cellule par CV-B4, l’ARN génomique est directement traduit en une seule polyprotéine virale par les ribosomes cellulaires, par le biais de la séquence IRES (Internal Ribosome Entry Site) de l’ARN viral .
Cycle de réplication
CV-B4, comme tous les entérovirus, se transmet essentiellement par voie fécale-orale. L’infection se répand après franchissement de la paroi intestinale (Pister et al., 2001). Lorsque le virus rencontre une cellule permissive, il s’attache à un récepteur cellulaire spécifique. Le récepteur le plus courant des CV-B est CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor), une molécule d’adhésion interagissant notamment avec le cytosquelette et la matrice extracellulaire (Loustalot et al., 2016). Un autre récepteur potentiel des CV-B est DAF (Decay Accelerating Factor) ou CD55, un régulateur du système du complément (Clarke and Tenner, 2014). Une fois le virus fixé à son récepteur, le complexe est endocyté, et l’ARN viral est injecté dans le cytoplasme de la cellule hôte. Directement après, l’ARN viral est pris en charge par les ribosomes cellulaires via la séquence IRES, et traduit en une seule polyprotéine. Dès sa traduction, la polyprotéine sera clivée en série jusqu’à-ce que les protéines virales matures soient obtenues. La polyprotéine est clivée par des protéases en cis (protéases présentes dans la séquence de la polyprotéine) dans un premier temps, puis par des protéases en cis et en trans (protéase présente sur une autre molécule que la protéine clivée). Le premier clivage de la polyprotéine s’effectue entre P1 et P2, par la protéase 2Apro en cis. Cette protéase est également responsable du clivage de certaines protéines cellulaires, telles que les facteurs d’initiation de la traduction des ARN cellulaires eIF4GI et eIF4GII, favorisant ainsi la traduction des protéines virales au détriment de la traduction des protéines cellulaires (Gradi et al., 1998). L’autre clivage majeur de la polyprotéine virale a lieu entre les régions P2 et P3 de la polyprotéine, et est effectué par la protéase 3Cpro. La 3Cpro et la protéase 3CDpro effectuent également des clivages secondaires dans les protéines précurseurs P1, P2 et P3. Les clivages effectués sur les précurseurs P1, P2 et P3 permettent l’obtention des protéines virales matures. Parmi les protéines non structurales se trouve la protéine 3Dpol. Il s’agit de l’ARN polymérase ARNdépendante du virus. La réplication de l’ARN viral se fait à la surface d’une vésicule cellulaire de 200 à 400nm de diamètre, aux propriétés similaire à celles d’un autophagosome, dont la synthèse est induite par différentes protéines du virus (Ng et al., 2008). De nombreuses protéines interviennent lors du processus de réplication de l’ARN viral. La protéine 2BC reste longuement sous la forme de précurseur des protéines 2B et 2C, et induit notamment la formation de la vésicule de réplication. La protéine 2B intervient par la formation de pores membranaires, bien que sa fonction précise dans la synthèse d’ARN ne soit pas exactement connue. La protéine 2C possède une activité NTPaseessentielle à la réplication de l’ARN viral. Certains antiviraux, tels que le guanidine hydrochloride ou la fluoxétine, ciblant la protéine 2C entraînent une diminution importante de la synthèse d’ARN viral, attestant de l’importance de 2C dans la réplication de l’ARN viral (Bauer et al., 2019). La 3Dpol réplique l’ARN viral en se servant de l’ARN génomique de polarité positive comme matrice pour synthétiser de l’ARN complémentaire de polarité négative, qui est un intermédiaire de réplication au virus. L’ARN négatif servira donc à transcrire davantage d’ARN positif pour la synthèse de protéines. La traduction massive des protéines virales permet d’avoir suffisamment de protéines structurales pour former les capsides virales. Dans un premier temps, les protéines VP1, VP3 et VP0 (protéine virale immature formée de VP2 et VP4) forment un monomère.Ces monomères constitués de VP1, VP3 et VP0 s’organisent ensuite en pentamères. L’assemblage de 12 pentamères forme la capside du provirion immature, qui deviendra virion mature lors du clivage de VP0 en VP2 et VP4 (Pister et al., 1992). Les pentamères s’associent ensuite à l’ARN viral génomique, au niveau des vésicules cellulaires à la surface desquelles l’ARN est répliqué. La vésicule de réplication empêche l’assemblage du virion, ainsi, la capside ne s’assemble complètement que lorsque l’ARN est entièrement synthétisé (Pister et al., 1992). Les capsides contenant l’ARN génomique du virus sont alors des provirions capables d’infecter de nouvelles cellules une fois libérés de leur cellule hôte (Figure 2).
Des mécanismes cellulaires tels que l’apoptose et l’autophagie interagissent avec la réplication du virus. Il a été observé que l’infection par un entérovirus induit l’apoptose des cellules infectées (Desailloud et al.,2009 ; Joo et al., 2002 ; Yuan et al., 2003). Les mécanismes d’induction d’apoptose sont divers. L’infection par un entérovirus active notamment de manière transcriptionnelle et traductionnelle la caspase 3, ainsi que le clivage de la procaspase 3 (Yuan et al., 2003). L’infection par CV-B3 induit la libération de cytochrome c, et le clivage des pro-caspases 2, 3, 6, 7, 8 et 9 (Carthy et al., 2003). L’activation conformationnelle de la protéine pro apoptotique Bax a également été documentée lors de l’infection à entérovirus (Cong et al., 2016). L’induction de l’apoptose est mise à profit par le virus pour la libération des virions néo-formés. CV-B4 utilise des voies similaire pour favoriser sa libération, en interagissant à la fois avec les voies d’apoptose et de nécrose (Jensen et al., 2013).
Plusieurs études ont démontré que l’induction de l’autophagie favorisait l’infection par les entérovirus (Lai et al., 2016 ; Lee et al., 2014). L’autophagie intervient lors de différentes étapes du cycle viral. Dès la réplication de l’ARN, le virus détourne cette fonction cellulaire pour permettre la formation de la vésicule de réplication (Salonen et al., 2005). L’autophagie est également mise à profit par le virus pour la libération des virions mature par la formation de vésicules autophagiques contenant des virus, et sortant de la cellule sans qu’il y ait de lyse cellulaire (Robinson et al., 2014 ; Garmaroudi et al., 2015 ; Bird et al., 2014 ; Mutsafi and Altan-Bonnet, 2018). La majorité des infections à CV-B sont asymptomatiques, mais des pathologies sévères peuvent également survenir. Des infections cardiaques à CV-B peuvent causer des myocardites ou péricardites. L’atteinte du système nerveux par le virus se traduit par une méningite, voire une encéphalite virale au pronostic réservé (Du Pasquier et al., 2009). Les CV-B sont impliqués dans diverses manifestations cliniques, telles que des polymyosites, certains cas d’hépatites, ou de pancréatites (Crowell et al., 1997). En plus d’un cycle lytique, et des nombreuses infections aiguës dont les CV-B sont la cause, ils provoquent également des infections persistantes.
Infection persistante
La persistance des CV-B fait intervenir des mécanismes propres aux virus, tels que des modifications de l’ARN génomique, mais également des facteurs de l’hôte, notamment le métabolisme des cellules hébergeant le virus (Hober and Sauter 2010, Alidjinou et al., 2014). De 30 à 40% des cardiomyopathies dilatées sont dues à une infection persistante à CV-B (Huber and Lodge 1984). La persistance du virus est mise en évidence par la détection d’ARN de CV-B dans l’endomyocarde (KOIDE et al. 1992). Une délétion de 17 à 50 nucléotides en 5’ de l’ARN viral est observée dans le cas d’infections persistantes associées à une cardiomyopathie dilatée (Bouin et al., 2019). Les délétions terminales en 5’ du génome viral entraînent une réduction de l’effet cytopathique du virus en culture cellulaire, et une réplication virale ralentie (Jaramillo et al., 2016). Des CV-B dont l’ARN est délété en 5’ sont capables de persister dans des cellules cardiaques, mais également dans des cellules pancréatiques (chapman et al., 2008, Tracy et al., 2015). La persistance du virus est également permise lors de l’infection à CV-B de cellules progénitrices de neurones (Rhoades et al., 2011, Feuer et al., 2005). Il est suspecté que le statut de prolifération de ces cellules soit un des éléments permettant la persistance du virus. En effet, le cycle cellulaire joue un rôle primordial dans l’infection des cellules par des CV-B, et la persistance du virus dans les cellules (Feuer et al., 2002). L’ARN viral retrouvé dans ces cellules est essentiellement de l’ARN positif en début d’infection. Néanmoins, le ratio ARN positif et ARN négatif diminue au cours de l’infection pour tendre vers un ratio 1:1 (Feuer et al., 2009). L’équivalence entre l’ARN positif et l’ARN négatif suggère que le virus existe sous une forme d’ARN double brin (ARNdb). L’ARNdb, qui sert d’intermédiaire de réplication lors de l’infection, est plus stable que l’ARN génomique monocaténaire, permettant au virus de subsister dans la cellule (Tam et al., 1999). De tels mécanismes de persistance sont notamment mis en cause dans l’encéphalite causée par l’infection à CV-B (Feuer et al., 2009).
L’infection à CV-B de cellules pancréatiques induit d’ordinaire une lyse cellulaire massive (Anagandula et al., 2014, Alidjinou et al., 2014). Néanmoins, la détection d’ARN viral dans le pancréas de patients diabétiques suggère que les CV-B sont capables de persister dans les cellules pancréatiques (Ylipaasto et al., 2004). Les mécanismes permettant aux CV-B de persister dans le pancréas sont encore peu connus. Certaines souches de CV-B4 semblent cependant plus enclines à persister dans le pancréas. Des modifications de l’ARN génomique de CV-B4, entraînant des changements au niveau des protéines de surface de virus, ont été décrites (Yin et al., 2002). L’apparition de variants « persistants » de CV-B a pu être étudiée in vitro, et résulterait d’une coévolution entre les cellules infectées et le virus (Alidjinou et al., 2017 ; Pinkert et al ., 2011). Bien que la persistance du virus n’entraîne pas de lyse ou de dommages tissulaires immédiats, l’infection n’est pas sans conséquences (Jaïdane and Hober 2008). Outre la destruction directe des cellules β du pancréas par le virus, l’infection persistante par CV-B4 induit la production d’interféron α (IFN α) qui pourrait initier la réaction auto-immune observée dans le DT1 (Stewart et al., 1993). La réplication permanente du virus serait également un facteur favorisant l’inflammation du pancréas, et le recrutement de lymphocytes T autoréactifs (Hyoty 2002). Des travaux in vitro ont également montré que la persistance de CV-B4 E2 dans des cellules pancréatiques modifiait l’expression de gènes cellulaires et de micro-ARN (Sane et al., 2013 ; Engelmann et al., 2017). La persistance de CV-B au niveau des intestins est possible, bien que peu étudiée (Alidjinou et al., 2014, Riabi et al., 2012). La persistance des CV-B est documentée dans la cardiomyopathie dilatée et l’encéphalite chronique. La persistante de CV-B chez les patients avec un diabète de type 1 est fortement suspectée.
Diabète de type 1
Le diabète de type 1 est une pathologie qui se caractérise par une hyperglycémie chronique, due à une perte de fonction de l’insuline, hormone hypoglycémiante.
L’insuline
L’insuline est stockée dans les cellules β des îlots de Langerhans du pancréas sous formes de granules, dont la sécrétion est stimulée par le glucose sanguin. Avant d’être stockée dans ces granules, l’insuline doit subir, après sa traduction, plusieurs étapes de maturation. L’insuline est d’abord traduite sous la forme de préproinsuline, encore pourvue de son peptide signal, et du peptide C. La première étape de la maturation sera l’acheminement de la préproinsuline vers l’appareil de Golgi, accompagné du clivage du peptide signal par une enzyme, la signal peptidase (SPP (Kronenberg-Versteeg et al., 2018). Le résultat de ce clivage sera la proinsuline, composée des trois chaines A, B et C, et le peptide signal qui sera détruit par le protéasome (Kronenberg-Versteeg et al., 2018). L’adressage de la préproinsuline, et le clivage du peptide signal, sont accompagnés de la formation de deux ponts disulfure entre les chaînes A et B de la proinsuline. Dans l’appareil de Golgi, un autre clivage va être effectué. La pro-hormone convertase 2 (PC2) codée par le gène PCSK2, va cliver la proinsuline entre les chaînes A et C, entre les résidus Lys 64 et Arg 65 (Smeekens et al., 1992 ; Davidson et al., 1988). A ce stade de la maturation, les chaînes A et B sont reliées par deux ponts disulfures. La chaîne B est encore liée à la chaîne C, tandis que la chaîne A ne l’est plus. L’insuline encore immature va ensuite être acheminée par des granules. C’est dans ces granules d’insuline qu’aura lieu le dernier clivage de la proinsuline. La pro-hormone convertase 1 (PC1), codée par le gène PCSK 1, va permettre la séparation des chaînes B et C, en clivant entre les résidus Arg 31 et Arg 32. Ce deuxième clivage permettra la formation d’insuline mature, et de peptide C (Figure 3) (Smeekens et al., 1992 ; Davidson et al., 1988). Les granules d’insuline ainsi formés vont être stockés dans les cellules β. Le glucose sanguin entre dans la cellule β par le transporteur GLUT-2, et la glycolyse a lieu. L’augmentation du ratio ATP/ADP due à une glycolyse plus importante entraînera ensuite la fermeture de canaux à potassium sensibles à l’ATP, ce qui cause la dépolarisation de la membrane plasmique. Les canaux calciques voltages dépendants s’ouvrent alors et entraînent l’exocytose des granules d’insuline (Henquin 2000). L’insuline ainsi libérée va ensuite se fixer à son récepteur spécifique dans différents tissus, principalement le foie et le tissu adipeux, mais également au niveau du tissu musculaire. L’insuline induit la translocation du transporteur de glucose GLUT-4 au niveau de la membrane des cellules cibles. L’expression de GLUT-4 va permettre l’absorption du glucose sanguin dans les cellules hépatiques et adipeuses notamment. Ce phénomène s’accompagne d’une inhibition de la glycogénèse, et d’une augmentation de la synthèse du glycogène (Lee and Pilch, 1994).
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Table des matières
Introduction
Coxsackievirus B4
Taxonomie et Structure
Cycle de réplication
Infection persistante
Diabète de type 1
L’insuline.
Pathogénèse du diabète de type 1
Objectifs
Matériel et Méthodes
Lignées cellulaires
Cellules pancréatiques humaines
Macrophages dérivés de CMN humaines
Virus.
Détermination du titre viral
Infection des cellules
Test de viabilité à l’uptiblue et au bleu trypan
Extraction d’ADN et d’ARN
RT-PCR suivie d’une électrophorèse sur gel d’agarose
RT-PCR Quantitative
Quantification de l’insuline, de la proinsuline et du c-peptide
Immunofluorescence
Quantification de la méthylation de l’ADN
Extraction de protéines
Quantification de la protéine HERV-W Env
Digestion des protéines pour traitement en spectrométrie de masse
Spectrométrie de masse LC-MS/MS
Résultats
Partie I : Infection persistante à CV-B4 de cellules canalaires pancréatiques humaines primaires
I/ Les cellules canalaires pancréatiques humaines primaires peuvent être différenciées en ICA
sécréteurs d’insuline
II/ CV-B4 E2 peut persister dans des cellules canalaires humaines primaires in vitro
III/ L’infection persistante à CV-B4 E2 peut inhiber la production d’insuline par des cellules
canalaires pancréatiques humaines primaires différenciées
Synthèse
Partie II : Infection persistante à CV-B4 de cellules β et conséquences
I/ CV-B4 E2 infecte de manière persistante des cellules β pancréatiques
II/ L’infection persistante à CV-B4 E2 de cellules β pancréatiques provoque des modifications du
métabolisme de l’insuline
III/ L’infection persistante à CV-B4 E2 de cellules β pancréatiques modifie l’expression de
protéines cellulaires pancréatiques
IV L’infection persistante à CV-B4 E2 de cellules β pancréatiques provoque des modifications de
méthylation de l’ADN.
Synthèse
Partie III : Expression de HERV-W Env dans des cellules infectées par CV-B4
I/ Expression du gène HERV-W Env dans des cultures de macrophages humains primaires
infectées par CV-B4
II/ Expression du gène HERV-W Env dans des cultures de cellules pancréatiques humaines
primaires infectées par CV-B4
DISCUSSION
Partie I : Infection persistante à CV-B4 de cellules canalaires pancréatiques humaines primaires
Partie II : Infection persistante à CV-B4 de cellules β et conséquences
Partie III : Expression de HERV-W Env dans des cellules infectées par CV-B4
Conclusion
Liste des publications
Bibliographie
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